[发明专利]基于LNA的突变型富集下一代测序测定

摘要

披露了用于例如从肿瘤遗传物质的基于血液的来源(循环肿瘤细胞或血浆)中，或其中有限量的DNA例如肿瘤DNA可供使用的其他环境中，检测突变的超灵敏测定。在雌激素受体中对该测定进行了例证，但是该测定可针对其他基因中的靶突变进行广泛地定制。

主权项

一种检测双链DNA分子(dsDNA)的靶序列中的突变的方法，该方法包括：提供包含dsDNA的样品；使该样品与以下项接触：包含第一半功能NGS适配子序列的正向基因特异性引物，以及任选地包含一种或多种锁核苷酸的钳寡核苷酸，其中该正向引物和钳寡核苷酸是顺式的，并且其中该钳寡核苷酸与疑似包含一个或多个突变的区域中的靶基因的野生型序列杂交；进行第一轮的单链引物延伸PCR，以产生第一群体的扩增子；任选地纯化该第一群体的扩增子；使该第一群体的扩增子与以下项接触：与该第一半功能NGS适配子序列的一部分互补的第一通用引物，其中用该引物进行的扩增产生第一全功能NGS适配子序列，包含第二半功能NGS适配子序列的反向基因特异性引物，其中该反向引物相对于与该第一NGS适配子序列的一部分互补的引物是反式的，以及；与该反向引物上的该第二半功能NGS适配子序列互补的第二通用引物，其中用该第二通用引物进行的扩增产生第二全功能NGS适配子序列；进行第二轮的PCR(“PCR2”)，以完成包含第一和第二全功能NGS适配子序列二者的第二群体的扩增子的扩增；对该第二群体的扩增子进行测序；并且将该第二群体的扩增子的序列与参考野生型靶序列进行比较；由此检测该靶序列中的突变。