[发明专利]对CAS内切核酸酶系统、PAM序列和指导RNA元件的快速表征

摘要

提供了组合物和方法，用于对Cas内切核酸酶系统和包含此类系统的元件的快速表征，包括但不限于对PAM序列、指导RNA元件和Cas内切核酸酶的快速表征。本文描述了源自侧孢短芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌Mlc3、红色乳杆菌DSM 15814、戊糖片球菌SL4、Lactobacillus nodensis JCM 14932、硫磺单胞菌属物种SCADC、嗜热双歧杆菌DSM 20210、Loktanella vestfoldensis、三赞鞘氨醇单胞菌NX02、Epilithonimonas tenax DSM 16811、粘球生孢噬纤维菌的II型Cas9内切核酸酶系统。本披露还描述了用于细胞基因组中的靶序列的基因组修饰、用于基因编辑、以及用于将目的多核苷酸插入细胞基因组中的方法。

主权项

一种用于鉴定前间区序列邻近基序(PAM)序列的方法，所述方法包括：a)提供质粒DNA文库，其中所述质粒DNA中的每一个都包含在靶序列邻近处整合的随机化前间区序列邻近基序序列，所述靶序列可以被指导RNA/Cas内切核酸酶复合物识别；b)向所述质粒文库提供指导RNA和Cas内切核酸酶蛋白，其中所述指导RNA和Cas内切核酸酶蛋白可以形成能够将双链断裂引入所述靶序列的复合物，从而产生切割靶标文库；c)将衔接子连接至(b)中的切割靶标文库，允许对所述切割靶标文库进行扩增；d)扩增所述切割靶标文库，使得含有所述随机化PAM序列的切割产物被富集，从而产生富集的PAM在侧边的靶标的文库；e)对(a)中的文库和(d)中的富集的PAM在侧边的靶标的文库进行测序，并鉴定在所述质粒DNA的任一条链上与(b)中的切割靶标邻近的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列代表推定的前间区序列邻近基序序列；并且，f)相对于(a)中的质粒DNA文库，确定所述推定的前间区序列邻近基序序列内每个核苷酸的富集倍数。