[发明专利]一种特异性引物检测鼠源性成分的方法

摘要

本发明属于动物源性成分检测技术领域，具体涉及一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，工艺过程分为特异性引物设计合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤,该特异性引物根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成的，所述特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’‑GCCTTATAATTAATTGGAGGTA‑3’，下游引物R的碱基序列为5’‑AGCTATATTATGTGCTTGAT‑3’，基于鼠的线粒体细胞色素Cyt b基因序列，利用实时荧光定量PCR法检测鼠源性成分，具有良好的特异性和重复性，使得利用该引物进行的实时荧光定量PCR法检测鼠源性成分时的操作简便、耗时少、特异性高，避免了传统检测方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物造成的二次污染，为鼠源性成分的检测提供了新的途径。

主权项

一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，其特征在于工艺过程分为特异性引物设计合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤：(1)、特异性引物设计合成：根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成特异性引物，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’‑GCCTTATAATTAATTGGAGGTA‑3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’‑AGCTATATTATGTGCTTGAT‑3’；(2)、DNA提取：取鼠肌肉组织1g研磨成糜状，然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL，纯度为1.85，用RNase/DNase‑free H2O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL，备用；(3)、反应体系建立：以步骤(2)提取的DNA为模板，用特异性引物建立10μL的PCR反应体系，取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Master mixture，剩余部分用RNase/DNase‑free H2O补足，实现反应体系的建立，并设置平行试验；(4)、PCR扩增：将步骤(3)建立的反应体系置于实时荧光定量PCR仪上，设置以下条件：①、模板变性：95℃‑5min；②、QPCR扩增：95℃‑20s，60℃‑10s，72℃‑10s，40个循环，在72℃时采集荧光信号；③、熔解曲线：95℃‑5s，65℃to 97℃的速率为0.5℃/5s，1个循环；(5)、鼠源性成分分析结果评价：测定并加权计算实时荧光定量PCR产物平均Cp值，Cp值小于33，熔解曲线显示有明显的单一主峰，无非特异性PCR产物，表明利用该特异性引物能够检测到鼠源性成分，且特异性和重复性良好。