[发明专利]一种肝素前体硫酸化修饰酶的表达方法

摘要

本发明涉及一种肝素前体硫酸化修饰酶的表达方法，该方法涉及生物技术领域，具体涉及新的核苷酸序列、原核表达系统的构建和制备方法。将人工合成的6‑ost‑3序列连接到pET‑28a表达载体上，并转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，经IPTG诱导表达胞内可溶性蛋白。溶菌酶破碎细胞，并收集上清，经镍柱纯化获得6‑OST‑3酶蛋白，其比酶活为1.53U/mg。本发明使用大肠杆菌表达制备6‑OST‑3酶蛋白，具有实验条件简单、成本低廉的优点，6‑OST‑3作为工具酶对于大分子肝素的修饰合成具有重要意义。

主权项

一种肝素前体硫酸化修饰酶的表达方法，其主要特征在于所述方法包括如下步骤：(1)人工合成两端带有NdeI和XhoI酶切位点的6‑ost‑3序列，经双酶切后插入表达质粒pET‑28a的NdeI/XhoI的位点，获得表达质粒pET‑28a/6‑ost‑3。(2)将表达质粒pET‑28a/6‑ost‑3转化入大肠杆菌BL21感受态中，获得重组工程菌。(3)将工程菌接种至LB培养基中过夜震荡培养作为种子液，再将种子液以适当的接种量接种至LB发酵培养基中，当菌液吸光度至一定范围时加入IPTG在诱导表达，离心收集菌体。(4)菌体重悬于pH7.4的磷酸缓冲液，加入溶菌酶破碎细胞，离心收集上清。(5)溶菌上清经镍柱纯化，获得6‑OST‑3酶蛋白溶液。