[发明专利]一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其包括：S1：构建基础载体；S2：靶序列退火复性；S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切；S4：连接和转化；S5：重组质粒的鉴定和提取；S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切；S7：连接、转化和鉴定。其可获得能够特异性作用于草莓的CRISPR/Cas9载体，该载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点，用于草莓的遗传转化试验。

主权项

1.一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括：S1：构建基础载体以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.1所示的pSG01载体；以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.2所示的pSG02载体；以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ ID NO.3所示的pCCF001载体；以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ ID NO.4所示的pCCU001载体；S2：靶序列退火复性：合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；S4：连接和转化：配置连接体系，将S2获得的稀释后的DNA双链序列与S3获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；S5：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中振荡培养，分别以M13fwd和序列为SEQ ID NO.6所示的Oligo‑R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒，其中，M13fwd的序列为GTAAAACGACGGCCAGT；S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切：将S5得到的重组质粒和S1构建的pCCF001或pCCU001质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；S7：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将S6获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中，挑单菌落于LB/Kan液体培养基中振荡培养，并进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。