[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，属于间充质干细胞领域，所述分离及培养方法按如下步骤实施胶体分离步骤、组织块制备步骤、接种处理步骤、原代细胞培养及收获步骤、原代细胞传代步骤以及细胞传代步骤。本发明公开的脐带间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法对胶体进行分离，能够获得数量可观的原代细胞，适合大规模工业化生产。

主权项

一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，按如下步骤实施：SOO:胶体分离步骤：从采集瓶内取出脐带，测量所述脐带长度并记录，对所述采集瓶内部的保存液进行支原体检测；将所述脐带移送至无菌培养皿内，对所述脐带进行冲洗及去血渍并将所述脐带裁剪成数段；剔除所述脐带内部的血管及羊膜；从所述脐带中分离出华通氏胶，对所述华通氏胶进行洗涤；S10：组织块制备步骤：将所述华通氏胶转移至离心管，对所述华通氏胶进行离心处理；对所述离心管内部的洗涤液进行无菌检测，并对所述华通氏胶进行称重；向所述华通氏胶内部加入用于培养脐带充质细胞的专用培养基；将所述华通氏胶剪切成组织块，其与所述专用培养基混合后，形成组织块匀浆；S20：接种处理步骤：依据所述华通氏胶的重量继续加入适量所述专用培养基，直至所述组织块匀浆的浓度与预设浓度保持一致；采用电动移液器对所述组织块匀浆进行吹打，使其均匀混合；将所述组织块匀浆分成若干份，分别加入若干培养瓶内进行接种，并在若干所述培养瓶内加入所述专用培养基；S30：原代细胞培养及收获步骤：平置所述培养瓶使得所述组织块匀浆均匀分布于所述培养瓶的底部；将所述培养瓶置于含有二氧化碳且恒温恒湿的培养箱内；对所述培养瓶内部的所述专用培养基进行换液处理；当所述培养瓶内部的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，向所述培养瓶内加入消化酶进行消化处理；反复吹打瓶底直至所述细胞克隆团脱离，并将所述细胞克隆团转移至定容离心管内，加入适量的氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致；对所述定容离心管内部的混合物进行过滤，并将滤液收集至所述定容离心管内；S40：原代细胞传代步骤：观察装有原代细胞单个所述离心管内部的余下细胞沉淀量，依据所述余下细胞沉淀量合并多个所述离心管的内容物至一个离心管内；加入适量的氯化钠注射液并吹打重悬浮细胞，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致。去除所述离心管内部的上清液，在所述离心管内部加入所述专用培养基并吹打重悬浮细胞，在所述离心管内进行定容后依据S30步骤接种至所述培养瓶；S50：细胞传代步骤：当传代细胞的融合度与预设融合度一致时，向所述培养瓶内加入消化酶进行消化处理；反复吹打瓶底直至所述细胞克隆团脱离，并将所述细胞克隆团转移至定容离心管内，加入适量的氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致；去除所述离心管内部的上清液，在所述离心管内部加入所述专用培养基并吹打重悬浮细胞，在所述离心管内进行定容后依据S30步骤接种至所述培养瓶。