[发明专利]一种牙髓干细胞分离培养方法

摘要

本发明涉及牙髓干细胞分离培养领域，公开了一种牙髓干细胞分离培养方法，包括以下步骤将牙齿挤碎，露出牙髓组织，再将牙髓组织剪碎，收集到离心管中，使用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶分解牙髓组织；加入完全培养液终止分解，离心去上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，过滤获得原代细胞悬液；原代细胞种植密度采用1×104/cm2；2天后进行首次换液，后面3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行细胞收获及传代；按照1×4000/cm2种植传代细胞，待细胞达到70～90％的汇合度，进行细胞收获并再次传代。本发明通过规范牙髓干细胞分离培养的方法及具体操作中的各项参数，提高牙髓干细胞分离培养效率、产出率，降低生产成本。

主权项

一种牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，分离干细胞，将牙齿用灭菌过的纱布包裹住，置于台钳中，挤碎牙齿露出牙髓组织，将牙髓组织用剪刀剪碎，收集到离心管中，加入完全培养液保湿，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓组织30min；S2，制备单细胞悬液，加入5倍于Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶总体积的完全培养液来终止分解，采用1000rpm离心10min，去除上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，使用70μm的滤网过滤获得原代细胞悬液；S3，细胞种瓶，原代细胞种植密度采1×104cell/cm2，或者按照一颗牙齿种植一个T25培养瓶；S4，形成克隆，2天后进行首次换液，后面完全培养液每3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行原代细胞收获及传代；S5，细胞传代，按1×4000cell/cm2种植传代细胞，间隔3至4天换液，待细胞生长达到70％～90％的汇合度时，进行传代细胞收获并再次传代。