[发明专利]一种猪源胶原膜‑自体软骨细胞复合支架的构建方法

摘要

本发明公开了一种猪源胶原膜‑自体软骨细胞复合支架的构建方法，具体步骤为取患者关节软骨，震荡清洗；将软骨组织剪碎；得到细胞悬液；沉淀即为软骨细胞；取无菌干燥猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，置于无菌塑料平皿中，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；待胶原膜吸附细胞10‑15min后，即可。本发明具有治疗效果好等优点。

主权项

一种猪源胶原膜‑自体软骨细胞复合支架的构建方法，其特征在于：具体步骤为：（1）、取患者非承重区的关节软骨约200‑300mg，剔除干净软组织，将剩余透明的软骨组织块放入盛有PBS缓冲液的离心管中，震荡清洗，直至残留的血液漂洗干净为止；（2）、在无菌平皿中，用眼科剪刀将软骨组织剪碎成1 mm3的碎片；（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎块30min，吸弃上清；（4）、再用0.02%（m/v）Ⅱ型胶原酶5ml于37℃，5%的CO2 培养箱中对碎片消化8‑10h，其中每隔1小时震荡一次，直至成絮状，得到细胞悬液；（5）、采用100um滤网对细胞悬液进行过滤，加入含FBS的高糖DMEM 培养基终止消化，其中高糖DMEM 培养基中的FBS的体积浓度为10%，在1000‑1500rpm的条件下,离心5min，弃上清，沉淀即为软骨细胞；（6）、将软骨细胞用含FBS、庆大霉素的高糖DMEM 培养基悬浮，调节至1×108/L，其中高糖DMEM 培养基中的FBS的体积浓度为10%，高糖DMEM 培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml，然后接种于25cm2培养瓶内，每瓶5ml，置于37℃，5%的CO2培养箱培养，每隔3天更换高糖DMEM 培养基一次，其中该高糖DMEM 培养基中也含10%FBS、45ug/ml庆大霉素；（7）、待软骨细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；（8）、向培养瓶内加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的CO2温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM 培养基终止消化；（9）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖DMEM 培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；（10）、用含10%（v/v）FBS、庆大霉素45ug/ml的高糖DMEM 培养基培养基调节细胞浓度为1×108/L，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；（11）、细胞培养3‑4周后，细胞传代3次，可扩增至15‑20×106；（12）、吸干培养液，培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM 培养基终止消化；（13）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；（14）、用0.3‑1ml生理盐水重悬细胞；（15）、取无菌干燥猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，再根据膜的面积，细胞数为0.5‑2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；（16）、待胶原膜吸附细胞10‑15min后，即可。