[发明专利]基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为制备骨髓悬液；取患者外周血，置于血袋中；制备自体血清；得到目的细胞；取15ml DMEM高糖培养基加入到目的细胞内，接种于T25细胞培养瓶中，置于培养箱中培养；用PBS液轻洗细胞两次；向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；得到清洗后的沉淀；将细胞接种于细胞培养瓶内继续培养；细胞传代3次；向培养瓶内加入胰蛋白酶‑EDTA溶液；用PBS洗涤细胞3次；重悬细胞；取一个无菌猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，放置于无菌塑料培养皿中，用高糖DMEM培养基浸泡过夜；将细胞悬液滴入猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜上，培养3天。本发明具有治疗精确度高等优点。

主权项

一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，其特征在于：具体步骤为：（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；（2）、在无菌条件下，取患者外周血100‑200ml，置于血袋中，密封；（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50ml PBS，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；（5）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后取15ml 含自体血清和硫酸庆大霉素的DMEM高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×105/ cm2接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基也含10%自体血清和40U/ml硫酸庆大霉素；（6）、 细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶‑ EDTA 溶液，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的CO2温箱2‑3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖DMEM培养基终止消化；（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖DMEM培养基，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；（9）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后取含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖DMEM培养基调节细胞浓度为1×108/L，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；（10）、细胞培养3‑4周后，细胞传代3次；（11）、 吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶‑ EDTA 溶液，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；（12）、将细胞悬液离心7min，弃上清，再用PBS洗涤细胞3次；（13）、细胞计数，向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ml；（14）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，取一个无菌猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，糙面朝上，光面朝下放置于无菌塑料培养皿中，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖DMEM培养基浸泡过夜；（15）、将步骤（13）制备得到的细胞悬液滴入准备好的猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜上，细胞数约1×106/cm2，继续培养3天，即可。