[发明专利]重组枯草芽孢杆菌串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1－F2蛋白

摘要

本发明涉及串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1‑F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了禽流感病毒HA‑PB1‑F2蛋白重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒plnHAPB1‑F2，并成功化学转化和电击转化入枯草芽孢杆菌WB600。经Western‑blot验证串联表达的禽流感病毒HA抗原片段和PB1‑F2蛋白在重组枯草芽孢杆菌内可以被成功表达。口服免疫一日龄SPF雏鸡后，可以刺激鸡体产生有效HA‑PB1‑F2特异性免疫应答水平，同时显著增强非特异性免疫。重组枯草芽孢杆菌有望成功开发成预防家禽高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

主权项

串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1‑F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒pInHAPB1，是由以下方法构建而成：1.1高致病性禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因的克隆；以含有血凝素的质粒pCI‑H5HA(哈尔滨兽医研究所陈化兰惠赠，NCBI编号是AF144305)为模板，设计引物进行PCR扩增。在上游引物引入与GFP末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入与PB1‑F2末端16bp的同源臂序列。引物序列如下：P1：GGCATGGATGAACTATACAAATACCATGCAAACAACTCGP2：CACTTCCACCTCCACCGCAAATTCTGCATTGTAACPCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因序列SEQ ID NO.1。1.2高致病性禽流感H5N1病毒PB1‑F2基因的合成：参照已发表的H5N1的PB1‑F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，设计一对扩增PB1‑F2蛋白基因的引物，在上游引物引入与HA 3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG 5’末端16bp的同源臂序列，在下游序列与载体之间引入BamH1酶切位点(下划线为酶切位点)。引物序列如下：P3：GTGGAGGTGGAAGTAGGAGGATGGAACAGGAACAGGP4：GGTACCAAGCTTTTAGGATCCTCCAGTTTATCCACTCTTG参照已发表的H5N1的PB1‑F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，将PB1‑F2序列送去南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以P3、P4为引物合成的PB1‑F2为模板进行PCR扩增增强肠道DC活性的PB1‑F2蛋白。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得低致病性禽流感H5N1病毒PB1‑F2基因序列SEQ ID NO.2。1.3融合HA和PB1‑F2片段用重叠PCR将扩增的HA与PB1‑F2使用P1，P4引物以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为模板进行PCR扩增获得目的片段HA‑PB1‑F2。PCR反应反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收获得HA‑PB1‑F2基因序列SEQ ID NO.3。1.4绿色荧光蛋白基因GFP的克隆参照已发表的绿色荧光蛋白基因序列(GenBank登陆号：KU312311.1)设计一对扩增绿色荧光蛋白基因GFP的引物，在上游引物引入与载体基因3’末端16bp的同源臂序列，两序列之间引入Xba1酶切位点(下划线为酶切位点)；在下游引物引入与HA蛋白5’末端16bp的同源臂序列，引物序列如下：P5：AAGAAATACAAATCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTP6：TCGAGTTGTTTGCATGGTATTTGTATAGTTCATCCATGCC以pINAmyE‑CotG‑GFPCOE‑FimH质粒为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得绿色荧光蛋白基因GFP的基因序列SEQ ID NO.4。1.5整合表达载体pInHAPB1的构建将回收的SEQ ID NO.3序列和SEQ ID NO.4序列使用One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒克隆至载体骨架pInAmyE‑CotG(Xba1和BamH1酶切后pINAmyE‑CotG‑GFPCOE‑FimH胶回收获得)。测序后获得整合表达载体pInHAPB1。