[发明专利]采用De novo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法

摘要

本发明公开了一种通过De novo转录组测序，转录本拼接和差异表达分析，鉴定蔻氏隐甲藻中与二十二碳六烯酸(DHA)生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法。具体步骤包括：(1)对隐甲藻进行DHA发酵培养；(2)收集不同生长和DHA积累阶段的菌体并进行RNA提取与转录组Illumina深度测序；(3)测序数据的分析与预处理；(4)对拼接后的转录组进行功能注释与相关性统计分析，鉴定发现隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶，并获得其基因全长序列；(5)通过qRT‑PCR分析技术，对隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶的基因进行表达验证。发明为研究隐甲藻DHA的生物合成机制以及提高隐甲藻中DHA合能力成提供重要的方法和知识基础。

主权项

基于二代测序技术的寻找隐甲藻中与DHA生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：将新鲜隐甲藻细胞在7.5L的发酵罐中进行补料培养，收集不同生长阶段的隐甲藻细胞进行分析，发现隐甲藻具有显著油脂积累差异特征的阶段，确定最佳样本时期；2)样本收集,RNA提取及转录组测序：对步骤(1)所获取差异油脂含量和成分的隐甲藻细胞，利用德国Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒进行微生物细胞总RNA的抽提操作，并利用Ribo‑ZeroTM rRNA removal Kit(Plant Leaf)去除残余rRNA，并分别进行cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、SPIA扩增、扩增产物的分离纯化，最终得到cDNA文库；3)转录组测序及数据分析：对步骤(2)所获取的RNA测序文库，使用美国Illumina公司的HiSeq 2500测序仪，按照说明书进行RNA测序文库的测序及数据分析；4)基因功能注释与统计分析：对步骤(3)所获取的转录组结果，使用NGS QC Toolkit、Trinity、以及RSEM等相应生物信息学手段和统计分析，鉴定在油脂和DHA积累阶段特异性表达的脂肪酸去饱和酶；5)DHA生物合成关联基因表达的qRT‑PCR的验证：对步骤(4)所获取的与DHA生物合成相关的基因，使用UltraSYBR Mixture对目标基因进行qRT‑PCR分析验证。