[发明专利]一种高活性漆酶突变体蛋白及其制备方法

摘要

本发明涉及医药学技术领域，具体涉及一种高活性漆酶突变体蛋白，其突变体是由野生型漆酶的基因突变得到，所述突变体为CH6‑CotA，CH6‑F207Y，CH6‑V403T，CH6‑P455S，CH6‑TS或CH6‑TSY中的任意一种。本发明以野生型漆酶NH6‑CotA为模板，扩增CotA基因，然后将CotA基因和pET22b载体分别双酶切，酶切产物通过连接、转化和测序构建His标签在C端的突变体CH6‑CotA菌株，然后再通过定点突变和组合突变得到高活性漆酶蛋白的突变体。与野生型漆酶相比，本发明构建的漆酶突变体的活性得到显著提升，从而为漆酶更加广泛地应用于工业生产中奠定了基础。

主权项

1.一种高活性漆酶突变体蛋白的制备方法，其特征在于：所述漆酶突变体蛋白的制备方法包括如下步骤：/na）引物设计：CH6-P455S的正、反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14所示；/nb）DpnⅠ酶切消化：分别用各对正、反向引物对pET22b/CotA质粒进行扩增，将扩增产物用DpnⅠ酶在37℃下酶切5h，扩增条件：94℃，5min；94℃，1min；68℃，30s；72℃, 1min，循环30次；72℃，5min；4℃保温；/nc）退火、纯化回收：将酶切产物混合，72℃反应8-12min后室温退火，将退火后的产物用试剂盒纯化回收；/nd）转化、测序：将回收产物转化到感受态DH5α大肠杆菌中，平板培养，挑取单菌落测序，得测序正确的高活性漆酶衍生物的突变体CH6-P455S菌株，所述CH6-P455S菌株表达的突变体漆酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CH6-P455S菌株表达的突变体漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；/ne）以CH6-P455S的质粒为模板，SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列为正、反向引物对模板进行扩增，扩增产物按照步骤b）的条件DpnⅠ酶切消化，之后重复步骤c）、d），得双突变的突变体CH6-TS 菌株，所述CH6-TS菌株表达的突变体漆酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CH6-TS菌株表达的突变体漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；/nf）以CH6-TS的质粒为模板，SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为正、反向引物对模板进行扩增，扩增产物按照步骤b）的条件DpnⅠ酶切消化，之后重复步骤c）、d），得三突变的突变体CH6-TSY菌株，所述CH6-TSY菌株表达的突变体漆酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述CH6-TSY菌株表达的突变体漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；/n将获得的各突变体菌株经过如下处理，进行蛋白表达，获得所需的漆酶突变体蛋白：/n1）将保存在-80℃条件下的突变体菌株划线到LB固体平板中，在37℃条件下过夜活化；/n2）挑起活化的单菌落于10 mL 有氨苄抗性的液体LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下过夜活化做种子液；/n3）按0.5％的接种量将种子液接种于1L有氨苄抗性的液体LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养；/n4）当OD