[发明专利]一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法

摘要

本发明属于苦瓜分子生物学技术领域，具体涉及一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法。一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，包括如下步骤研磨、加入试剂A水浴、离心、加入试剂B离心、抽提、离心、沉淀和溶解，然后得到苦瓜单粒种子DNA。本发明的提取方法不需对种子进行任何处理，提取DNA可以满足后续分子生物学试验。通过与常规的苦瓜叶片提取DNA相比较，本发明的鉴定方法具有检测速度快、成本低、结果可靠的特点。

主权项

一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将其剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45‑60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；(3)水浴后，用离心机离心10min；(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3‑5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15‑20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于‑20℃下保存，备用。