[发明专利]一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及海参养殖水体青苔爆发的防控与预警领域，具体地说是一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的动态监测方法。长石莼、硬石莼和萱藻是海参养殖池塘青苔爆发的重要种类，但其孢/配子个体较小，传统方法很难检测。通过针对三种大型藻类ITS区设计特异性引物，优化荧光定量PCR条件，最终利用定量PCR法实时监测养殖水体三种大型藻类孢子/配子的动态。结果显示，海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子量的动态变化与青苔爆发规律吻合较好。本发明提供的方法能够快速、有效、高灵敏度地监测海参养殖水体三种大型藻类的动态变化，为可能的青苔爆发提供预警。

主权项

一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：1)设计ITS区特异性引物：在长石莼、硬石莼和萱藻18S rDNA序列右端和ITS序列区域分别查找涵盖部分ITS区或ITS区全长的物种特异性引物；分别选取序列相似性高于90％的同属或同科物种作为参考，进行特异性位点查找；使用Intergrated DNA Technologies网站对所得特异性引物的GC含量，Tm值，引物二聚体形成，发卡结构产生等参数进行在线评估，筛选得出高质量引物对；2)引物特异性验证：利用NCBI的BLASTn功能和Primer‑BLAST在线软件对步骤1)中所得引物的特异性进行验证；以实验室对照藻类和养殖水样DNA为模板，扩增其ITS序列，验证引物特异性和普适性；3)定量PCR条件优化：利用包含目标片段的标准线性DNA构建标准曲线，回归系数达到0.98以上，扩增效率为大于90％；5)定量PCR法实时监测海参养殖水体大型藻类孢子/配子的数量。