[发明专利]一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法

摘要

本发明涉及一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，属于生物制药技术领域。本发明是研究和开发了一种通过构建和筛选病毒基因由Mu噬菌体转座子介导的高密度随机插入突变体库，获得弱毒活疫苗候选毒株的方法，并开发了一套对所获得的弱毒活疫苗毒株进行系统性评价的技术体系。这些方法不但可以直接应用于流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和评价，而且对于其他病毒弱毒活疫苗的研制和开发有广泛的借鉴意义。

主权项

一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1) 利用Mu噬菌体转座子介导的随机插入技术建立M基因的高密度突变库：利用Finnzymes公司Mu噬菌体转座子介导的随机插入突变试剂盒向流感病毒A/WSN/1933的M基因各个碱基间插入5’‑NNNNNTGCGGCCGCA‑3’这一15nt长的寡核苷酸序列，从而获得流感病毒M基因的高密度突变库；(2) 通过流感病毒反向遗传学技术获得病毒突变体库：用电转化的方法将携有M基因突变体的质粒转化入大肠杆菌DH10B感受体细胞，从重组菌种提取M基因突变体库质粒，然后利用A/WSN/33 H1N1流感病毒8质粒病毒反向遗传学操作系统获取病毒突变体库；(3) 通过第二代测序技术对病毒突变体库组分进行分析：取步骤(2)获得的病毒突变体库病毒在MDCK细胞上进行传代，然后利用TRIzol试剂提取病毒RNA，并对各RNA按照反转录试剂盒iScriptTM cDNA Synthesis kit进行反转录产生相应的cDNA，以该cDNA为模板，分别使用3个M基因的特异性正向引物，其序列分别为SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，与Vic标记的插入序列特异性反向引物做PCR扩增，由PCR获得的荧光标记PCR产物设置一次重复和Liz‑500分子量标准利用96‑毛细管3730xl DNA分析仪进行测序，所产生的数据应用ABI软件进行分析，去除PCR过程、引物及测序仪器产生的非特异性数据；(4) 小鼠体内筛选流感病毒弱毒活疫苗候选毒株：首先通过超速离心的方法浓缩突变体库病毒，测定其病毒滴度后用于后续小鼠感染实验，病毒通过滴鼻的方法感染6‑8周龄的C57/B6小鼠，分别在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺脏组织并进行匀浆处理，从肺组织匀浆中用TRIzol试剂提取总RNA，依照上述步骤（3）中方法对样本中病毒M基因进行测序并进行定性和定量分析，根据不同M基因突变病毒在各样本中的存在情况，确定弱毒活疫苗候选毒株；(5) 弱毒活疫苗候选毒株遗传稳定性和安全性评价：（a）弱毒活疫苗的分离和表型鉴定：首先对上述弱毒活疫苗候选毒株进行了单克隆化，对其中能在MDCK细胞中能够有效复制的W7‑757、W7‑791和W7‑797三株病毒进行扩增，初步筛选出表现出更好的复制能力和较低的细胞毒性的W7‑791病毒；（b）弱毒活疫苗遗传稳定性检测：将W7‑791病毒在MDCK细胞和小鼠体内进行传代，对从细胞或小鼠肺脏匀浆中获得病毒的基因序列中的M基因的序列进行测定， 确定W7‑791病毒M基因的突变能够被稳定地遗传下去；（c）弱毒疫苗的安全性评估：用不同滴度的W7‑791病毒免疫6‑8周龄小鼠，没发现小鼠产生体重下降及流感症状；给15日龄的新生BALB/c小鼠滴鼻接种不同滴度的W7‑791或104 TCID50 的野生型WSN病毒，对小鼠体重和肺脏病变进行检测，W7‑791接种小鼠上未观察到像野生型WSN病毒感染小鼠那样的体重下降和肺部病变，由此确定W7‑791病毒即为流感病毒弱毒活疫苗毒株。