[发明专利]一种高分辨率核酸结合/熔解荧光的检测方法

摘要

本发明涉及一种高分辨率核酸结合/熔解荧光检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供的高分辨率核酸结合/熔解荧光检测方法，包括以下步骤：1)预测RNA‑RNA相互作用区域；2)所述RNA‑RNA相互作用区域内序列多态性分析；3)以所述步骤2)得到的相互作用区域内的含1～5个靶位点的序列为模板，合成相互作用区域内的寡核苷酸片段；4)利用Realtime‑PCR对升温与降温过程中相互作用的寡核苷酸片段结合产生的荧光强度数值进行检测；5)根据所述荧光强度数值绘制荧光变化曲线。本发明提供的检测方法检测效率高、灵活性好，且配套条件简单，实验成本低。

主权项

一种高分辨率核酸结合/熔解荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)预测RNA‑RNA相互作用区域；所述RNA‑RNA包括miRNA及其靶基因或lncRNAs及其靶基因；所述miRNAs及其靶基因相互作用区域的预测方法包括：利用psRNATarget在线预测工具进行预测，所述预测方法的规则包括：最大期望值:0～1.0；互补区域的长度：18～19bp；未匹配靶位点的最大能量：15～20；靶位点的侧翼长度:上游17bp/下游13bp；导致延伸抑制的中央错配范围：9～11nt；所述lncRNAs及其靶基因相互作用区域的预测方法包括：利用Blast进行序列互补计算，所述序列互补计算时的参数设置为E value＝1e‑10，identity＝90％；将所述互补计算得到的序列再利用RNAplex进行热力学上的互补计算，参数设置为e＝‑40；2)对所述步骤1)得到的RNA‑RNA相互作用区域内序列进行多态性分析，筛选得到多态性位点作为靶位点；所述多态性分析的方法包括：当分析对象为模式物种时，通过物种重测序数据库进行相互作用区域内的SNPs、InDels位点的发现，所述位点在群体中的频率均大于5％；当分析对象为非模式物种时，通过克隆相互作用区域cDNA全长进行相互作用区域内的SNPs位点的发现，至少利用20个没有亲缘关系的个体进行序列多态性分析；3)以所述步骤2)得到的相互作用区域内的含1～5个靶位点的序列为模板，合成相互作用区域内的寡核苷酸片段；4)将所述步骤3)得到的任意两条相互作用区域内的寡核苷酸片段与饱和荧光染料混合，利用Realtime‑PCR进行升温处理，通过相互作用的寡核苷酸片段产生的荧光强度检测寡核苷酸序列的熔解；利用Realtime‑PCR进行降温处理，通过相互作用的寡核苷酸片段产生的荧光强度检测寡核苷酸序列的结合；5)根据所述步骤4)得到的荧光强度绘制荧光随温度的变化曲线，曲线的峰值对应的温度代表寡核苷酸结合或熔解一半时所需要的温度；在降温处理中，所述峰值对应的温度越高，则代表RNA‑RNA结合能力越强；在升温处理中，所述峰值的温度越高，则代表RNA‑RNA形成的互补双链结构稳定性越强。