[发明专利]一种高效稳定广谱紫花苜蓿遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种高效稳定广谱紫花苜蓿遗传转化方法，包括以下步骤：(1)灭菌材料的准备；(2)农杆菌的准备；(3)侵染；(4)组织培养。本发明建立了农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系，为通过转基因技术深入研究并发掘紫花苜蓿的基因功能奠定了基础，也为紫花苜蓿的分子改良创造了条件。本发明将7个品种在相同的背景下(相同的转化载体、相同的插入基因、相同的外植体数)进行比较，较为科学、准确的进行了紫花苜蓿代表性品种(中国东北、华北、西北和国外引进的代表品种)的分子遗传转化研究，能够代表中国大多数紫花苜蓿品种的情况，建立了一个高效、稳定、广谱的紫花苜蓿遗传转化体系。

主权项

1.一种高效稳定广谱紫花苜蓿遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)灭菌材料的准备：①准备好紫花苜蓿各个品种的成熟叶片；所述的紫花苜蓿品种包括中苜三号、公农二号、甘农五号、新疆大叶、保定苜蓿、阿尔冈金和敖汉苜蓿，共七个品种；②外植体灭菌：将离体的叶片用70％乙醇浸泡30s，然后用20％的漂白剂和0.1％的SDS浸泡1.5min，最后用灭菌的蒸馏水清洗3‑4遍，每次5min；(2)农杆菌的准备：①5ml含有农杆菌LBA4404的LB培养基在250rpm，28℃下培养24h；②将5ml培养液放在25ml LB液体培养基中，于250rpm，28℃条件下振荡培养，直到OD值达到1.5；③菌液在4℃，3500rpm下离心15min，弃上清，用两倍的侵染培养基重悬菌体，使最终的OD值为0.8；此过程中要注意轻柔悬浮菌体，不要涡旋；(3)侵染：①将灭好菌的外植体在超净台中切成4cm见方的小块，切除边缘，放到盛有侵染培养基的杯子中，切好全部外植体后，将侵染培养基倒掉，加入农杆菌悬浮液，直到没过所有外植体；②轻轻搅动，侵染15‑20min；③将侵染完毕的外植体放到铺有灭菌滤纸的培养皿中，吹干外植体表面；④将外植体均匀摆放在共培养培养基上，数量为10‑15个/培养皿；所述的共培养培养基的具体组分及制备条件如表1所示，表1(4)组织培养：①用镊子将外植体小心摆放在共培养培养基上，在黑暗条件下培养2‑4天；②在灭菌的蒸馏水中清洗两次，晾干后继续在共培养培养基上培养4天；③在灭菌蒸馏水中清洗三次，吹干后放在选择培养基上；④3周左右长出愈伤，个别会长出胚状体；每隔20‑25天移到新的选择培养基，根据生长情况降低或撤掉筛选压，使产生更多含有胚性愈伤的愈伤组织；⑤将愈伤组织移到分化培养基上，3‑4周后分化出胚状体，每3‑4周继代一次，使其分化出更多胚状体；⑥将胚状体移到含有抗生素的1/2MS培养基上，使形成小苗；⑦打开培养钵盖子，炼苗3‑5天，然后移到土中，温室培养；⑧小苗足够强壮后，取部分组织进行分子检测；所述的分化培养基的具体组分及制备条件如表2所示，表2