[发明专利]一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析方法

摘要

本发明公开了一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析的方法。所述非蛋白氨基酸毒素在线与荧光标记试剂发生荧光衍生反应，荧光标记产物经由第一维液相色谱的多通阀切换进入第一维色谱的分离柱实现第一次富集、分离；然后将所得到的分离组分经由第二维多通阀中心切割进入第二维液相色谱分离柱，完成荧光标记物的第二次富集、分离和荧光高灵敏检测，从而实现非蛋白氨基酸毒素的在线衍生痕量荧光分析；所述的非蛋白氨基酸毒素为软骨藻酸。本发明综合应用了在线标记、二维色谱富集分离和荧光分析，流程连续、背景干扰小、灵敏度高，可用于超痕量软骨藻酸等非蛋白氨基酸毒素的准确分析。

主权项

1.一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析方法，其特征在于：所述非蛋白氨基酸毒素在线与荧光标记试剂发生荧光衍生反应，荧光标记产物经由第一维液相色谱多通阀切换进入第一维色谱分离柱实现第一次大体积进样富集、分离；然后将所得到的分离组分经由第二维多通阀中心切割进入第二维色谱分离柱，完成荧光标记产物的第二次大体积进样富集、分离和荧光高灵敏分析，从而实现非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析；所述非蛋白氨基酸毒素为软骨藻酸；所述方法是应用一种在线衍生‑二维液相色谱连续富集分离装置而实现的，所述的在线衍生二维液相色谱连续富集分离装置是由在线荧光衍生模块和二维液相色谱连续富集分离模块组成；所述在线荧光衍生模块包括荧光反应组件、流路输送及切换组件和反应终止组件，所述荧光反应组件包括样品溶液2、盐溶液3、荧光标记试剂4和在线反应管9，所述流路输送及切换组件包括注射泵7和注射泵8、三通阀6和蒸馏水1，所述反应终止组件包括无机酸溶液5；所述二维液相色谱连续富集分离模块包括多通阀11、多通阀16、馏分收集定量环10、馏分收集定量环15、第一维液相色谱分离柱14、第二维液相色谱分离柱19、高压泵13、高压泵18和荧光检测器20；所述馏分收集定量环10入口端与在线反应器9出口相连，在“进样”模式中出口端与第一维液相色谱分离柱14入口端相连，大体积连续进样；所述馏分收集定量环15入口端与第一维液相色谱分离柱14出口相连，在“进样”模式中出口端与第二维液相色谱分离柱19入口端相连，大体积连续进样；所述方法具体包括以下步骤：1）以体积比1：1：1将样品溶液2与盐溶液3和荧光标记试剂4在线混合，经三通阀6由注射泵7以流速125μL/min将三者混合液注入反应管9，连续注射荧光衍生反应液总体积为375μL；2）调节三通阀6控制流路，停止采集样品溶液2、盐溶液3和荧光标记试剂4；运行注射泵7以流速125μL/min注射蒸馏水1，驱动反应管9中衍生反应液；运行注射泵8以流速125μL/min注射无机酸溶液5，与上述蒸馏水1驱动的衍生反应液混合，终止荧光衍生反应，并将混合后溶液推入第一维液相色谱的馏分收集定量环10；3）切换多通阀11，以含体积分数0.1%三氟乙酸溶液、体积比为32：68的乙腈‑水溶液为流动相，经由高压泵13以流速1.0 mL/min将步骤（2）所得的反应液注入第一维液相色谱分离柱14进行预分离，分离产物进入第二维液相色谱的馏分收集定量环15；4）切换多通阀16，以含体积分数0.1%三氟乙酸溶液、体积比为46：54的乙腈‑水溶液为流动相，经由高压泵18以流速1.0 mL/min将步骤（3）所得的反应液注入第二维液相色谱分离柱19进行二次分离和荧光高灵敏检测，实现非蛋白氨基酸毒素的在线超痕量分析。