[发明专利]用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法

摘要

本发明公开了一种用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法。该方法包括如下步骤：1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体(缺失了黏蛋白样区域和C‑端穿膜区的博拉病毒糖蛋白)的基因导入受体酵母细胞中，得到重组酵母细胞；2)对重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得博拉病毒糖蛋白突变体。用本发明制备的埃博拉病毒糖蛋白突变体所制备的埃博拉出血热预防用疫苗，可诱导小鼠产生显著的针对埃博拉病毒糖蛋白的抗体滴度。本发明具有工程菌株构建、培养周期短、培养条件简单、成本低、适于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可进行蛋白质翻译后修饰加工扥典型特点，适合在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。

主权项

1.一种制备埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法，包括如下步骤：/n（1）将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因导入毕赤酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；/n（2）对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白突变体；/n所述埃博拉病毒糖蛋白突变体为缺失了黏蛋白样区域和C-端穿膜区的埃博拉病毒糖蛋白；/n步骤（1）中，所述编码埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因为如下（b1）-（b4）中任一所示DNA分子：/n（b1）序列表中序列2的第29-1468位所示DNA分子；/n（b2）序列表中序列2的第1-1468位所示DNA分子；/n（b3）序列表中序列2的第29-1507位所示DNA分子；/n（b4）序列表中序列2的第1-1507位所示DNA分子；/n步骤（2）中，进行所述破碎的方法为高压均质仪以600bar 的压力匀浆3次；/n步骤（2）中，进行所述破碎后还包括向破碎后的体系中加入终浓度为如下的各物质：8M尿素、50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液、500mM NaCl、10mM咪唑和体积百分含量为5%的甘油，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的粗提液的步骤；/n步骤（2）中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤；/n所述纯化为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析；/n进行所述亲和层析时，采用的介质为Chelating Fast Flow；采用的柱平衡液记为A液，所述A液组成如下：6M 尿素、500mM NaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、10mM咪唑和体积百分含量为5%的甘油，余量为水；采用的洗脱液记为B液，所述B液组成如下：6M 尿素、500mMNaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、500mM咪唑和体积百分含量为5%的甘油，余量为水；所用洗脱梯度为：（1）5%所述B液和95%所述A液，（2）50%所述B液和50%所述A液，（3）100%所述B液，%表示体积百分含量；所述埃博拉病毒糖蛋白突变体存在于所述“（2）50%所述B液和50%所述A液”的洗脱液中；/n进行所述凝胶排阻层析时，采用的介质为Sephadex G25；采用的流动相组成如下：20mMpH6.2的磷酸盐缓冲液、6M 尿素、体积百分含量为5%的甘油，余量为水；/n进行的所述离子交换层析为阳离子交换层析，所采用的介质为SOURCE 30S；采用的平衡液记为A’液，所述A’液组成如下：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M 尿素、体积百分含量为5%的甘油，余量为水；采用的洗脱液记为B’液，所述B’液组成如下：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M 尿素、体积百分含量为5%的甘油和1M NaCl，余量为水；所用洗脱梯度为：（1）5%所述B’液和95%所述A’液，（2）15%所述B’液和85%所述A’液，（3）30%所述B’液和70%所述A’液，（4）50%所述B’液和50%所述A’液，（5）100%所述B’液，（6）100% 0.5M NaOH，%表示体积百分含量；所述埃博拉病毒糖蛋白突变体主要存在于所述“15%所述B’液和85%所述A’液”的洗脱液中。/n