[发明专利]一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及一种生物检测技术领域，是一种鹿中结核分枝杆菌NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特点是，由根据结核分枝杆菌16srRNA基因保守区序列设计的特异性引物、捕获探针、检测探针，优化的NASBA扩增体系和优化的NASBA产物检测体系组成。能对鹿中结核分枝杆菌进行简单快速的检测，具有高效的特异性和容易推广的优越性，也有助于牛型和人型多重结核分枝杆菌的早期诊断；其检测方法是设计并人工合成结核分枝杆菌基因保守区序列的特异性引物、捕获探针和检测探针，确定NASBA扩增反应程序和NASBA产物检测体系等步骤，能够同时监测人型和牛型的多重结核分枝杆菌，检测结果灵敏度高且重复性好。

主权项

一种鹿中结核分枝杆菌NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特征是，它包括如下体系：1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)TB基因的一对特异性引物IS6110‑F:5’‑TGATGCAAGGTCGATATGAGAACGGAAAGGTCT CTTCGG‑3’，其中TGATGCAAGGTCGATATGAG与检测探针一致，IS6110‑R:5’‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTCATCCCACACCGCTAAAGC‑3’，其中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAG为T7启动子序列，(b)NASBA扩增缓冲液：Tris‑HCl为40mmol/L,pH8.5，NTP为10mmol/L，dNTP为1mmol/L，MgC12为10mmol/L，KCl为120mmol/L，DTT为5mmol/L，DMSO为100g/L；(c)NASBA扩增酶复合液：T7 RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：(a)TB基因的探针特异性探针，即捕获探针：5’‑Biotin‑AGTAACACGTGGGTGATCTGC‑3’，检测探针：5’‑TGATGCAAGGTCGCATATGAG‑DIG‑3’；(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0l25mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/L Tris‑HCl、pH8.5，1﹪(W/V)BSA；(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂杂交洗液：PBS、pH7.2，0.05％Tween‑20；显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O,加入1mL二乙醇胺，‑20℃避光保存；终止液：0.5mol Na2CO3溶液。