[发明专利]弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法及用途

摘要

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该方法敲除了弓形虫乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2两个基因，所述乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述乳酸脱氢酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述弓形虫基因敲除虫株在乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2位点分别具有如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

主权项

一种弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)出发虫株是具有乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2两个基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述乳酸脱氢酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；(2)pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgLDH2质粒的构建：以pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgUPRT为模板，使用Q5点突变试剂盒，利用上下游引物扩增，使用KLD酶连接、转化DH5α得到pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgLDH2质粒，其中，上、下游引物序列分别为：gRNA‑LDH2‑Fw：5’–AACCAGTATGAGAAGATCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’gRNA‑R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；(3)ldh2‑5UTR::DHFR::ldh2‑3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，扩增ldh2‑5UTR和ldh2‑3UTR，以pUC19质粒及含DHFR质粒分别扩增pUC19载体、DHFR药物筛选标签，通过多片段连接酶ExnaseTM MultiS连接上述4个片段，构建重组质粒pUC19‑ldh2‑5UTR::DHFR::ldh2‑3UTR，该质粒即乳酸脱氢酶2基因的敲除质粒，利用ldh2‑5UTR‑F、ldh2‑3UTR‑R扩增ldh2‑5UTR::DHFR::ldh2‑3UTR同源模板，其中，扩增pUC19、DHFR、ldh2‑5UTR和ldh2‑3UTR片段所用的引物序列分别为：pUC19Forward：5’–TGTGAAATTGTTATCCGCTC–3’pUC19Reverse：5’–AACGTCGTGACTGGGAA–3’DHFR‑Fw：5’–TGTAAAACGACGGCCAGTC–3’DHFR‑Rv：5’–CCAGGAAACAGCTATGACC–3’U5LDH2‑Fw：5’–GGTTTTCCCAGTCACGACGTT CGAAGCGACCATCGATACTG–3’U5LDH2‑Rv：5’–AGACTGGCCGTCGTTTTACA TACCCGTCATGGTGGAAGTG–3’U3LDH2‑Fw；5’–ATGGTCATAGCTGTTTCCTGG TCAGTTGATGACGTGGTGG–3’U3LDH2‑Rv：5’–GAGCGGATAACAATTTCACA GGACTGCCTGTGTTTGTTCG–3’；(4)弓形虫基因敲除虫株△LDH2的获得：将步骤(2)中的pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgLDH2和步骤(3)中的ldh2‑5UTR::DHFR::ldh2‑3UTR同源模板共电转至步骤(1)中所述出发虫株，通过1uM乙胺嘧啶筛选，PCR鉴定，获得乳酸脱氢酶2基因敲除虫株△LDH2，所述△LDH2敲除虫株缺失SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；(5)pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgLDH1质粒的构建：以pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgUPRT为模板，使用Q5点突变试剂盒，利用上下游引物扩增，使用KLD酶连接、转化DH5α得到pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgLDH1质粒，其中，上、下游引物序列分别为：gRNA‑LDH1‑Fw：5’–GCCGGTCTGACCAAGGTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’gRNA–R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；(6)Ldh1‑5UTR::CAT::ldh1‑3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，扩增ldh1‑5UTR、ldh1‑3UTR、以pUC19质粒及含CAT质粒扩增pUC19载体、CAT药物筛选标签，通过多片段连接酶ExnaseTM MultiS连接上述4个片段，构建重组质粒pUC19‑ldh1‑5UTR::CAT::ldh1‑3UTR，该质粒即乳酸脱氢酶1基因的敲除质粒，利用ldh1‑5UTR‑F、ldh1‑3UTR‑R扩增ldh1‑5UTR::CAT::ldh1‑3UTR同源模板，其中，扩增pUC19、CAT、ldh1‑5UTR和ldh1‑3UTR片段所用的引物序列分别为：pUC19Forward：5’–TGTGAAATTGTTATCCGCTC–3’pUC19Reverse：5’–AACGTCGTGACTGGGAA–3’CAT‑F：5’–CGCACTTGTGCAGAGGAGAAGAGGTCGACGGTATCGATAA–3’CAT‑R：5’–ATTCCGCTCCTGTTTTGCCACGCTCTAGAACTAGTGGATCGAT–3’U5LDH1‑Fw：5’–GGTTTTCCCAGTCACGACGTT GCAAACTCGTTGAGTAGCG–3’U5LDH1‑Rv：5’–TTCTCCTCTGCACAAGTGCG–3’U3LDH1‑Fw：5’–TGGCAAAACAGGAGCGGAAT–3’U3LDH1‑Rv：5’–GAGCGGATAACAATTTCACAACTGCTCACCCTGATGCAC–3’；(7)弓形虫基因敲除虫株△LDH1△LDH2的获得：将步骤(5)中的pSAG1‑Cas9‑TgU6‑sgLDH1和步骤(6)中的ldh1‑5UTR::CAT::ldh1‑3UTR同源模板共电转至步骤(4)中所述的基因敲除虫株△LDH2，通过同源重组，30uM氯霉素筛选，PCR鉴定，获得乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2基因缺陷的敲除虫株△LDH1△LDH2，所述△LDH1△LDH2敲除虫株缺失SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。