[发明专利]通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法

摘要

本发明公开了一种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。该方法针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况，包括如下：改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性。该方法可有效解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡，重要优点是，对类似HLA的复杂基因进行PCR扩增时，即使引物序列上出现新的未知的多态性位点时，也能较好的进行扩增，减少等位基因扩增不平衡，有效避免其中一个等位基因扩增失败而导致的检测错误，而且还避免了针对引物结合区存在不同多态性位点时，需设计大量不同序列匹配引物进行扩增的难题。

主权项

1.一种解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的方法，包括如下步骤：通过改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR扩增条件为：对所述待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR扩增条件；所述改变原有PCR扩增条件为如下中的任一种或任几种：(a)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，降低退火温度；(b)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，增加PCR缓冲液的离子浓度；(c)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，增加引物序列的长度；进行所述(a)、所述(b)或/和所述(c)时，以既能增强PCR扩增时引物的容错性又能保证所述待测等位基因的特异性扩增为度；所述(a)中，在已初步优化好的PCR扩增程序中，以梯度温度递减的形式逐步降低退火温度，一直降至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的退火温度；所述已初步优化好的PCR扩增程序为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的PCR扩增程序；所述(b)中，在已初步优化好的PCR扩增体系中，以梯度浓度递增的形式增加Mg2+浓度，一直增加至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的Mg2+浓度；所述已初步优化好的PCR扩增体系为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的PCR扩增体系；所述(c)中，在已初步优化好的引物中，以2‑3个碱基梯度递增的形式增加用于扩增所述待测等位基因的原有引物对中与靶基因序列不完全匹配的引物的长度，一直增加至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的引物长度；所述已初步优化好的引物为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的引物；所述待测等位基因为HLA基因；所述待测等位基因为基因型分别为B*46:01:01和B*51:01:02的HLA‑B基因；用于扩增所述待测等位基因的原有引物对为由上游引物BF和下游引物BR组成的引物对；所述上游引物BF的序列如序列表中序列1所示；所述下游引物BR的序列如序列表中序列2所示；其中，所述上游引物BF与基因型为B*51:01:02的HLA‑B基因不完全匹配；所述方法是通过进行所述(a)或所述(b)或所述(c)来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题的；当采用所述(a)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，所述退火温度由65℃降至62℃，其余PCR扩增条件不变；当采用所述(b)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，所述PCR扩增反应体系中Mg2+浓度由2.5mM升至5.5mM，其余PCR扩增条件不变；当采用所述(c)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，将所述上游引物BF的5’末端增加5个碱基，其余PCR扩增条件不变；当采用所述(a)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，用于扩增所述待测等位基因的引物对为所述原有引物对；所述PCR扩增体系中Mg2+浓度为2.5mM；所述PCR扩增体系组成如下：Mg2+浓度为2.5mM的1×PCR扩增缓冲液，终浓度为200μM的dNTP，终浓度为0.2μM的所述上游引物BF和所述下游引物BR，终浓度为0.075U/μl的DNA聚合酶，基因组DNA，余量为水；所述PCR扩增反应程序如下：96℃3min；96℃25s，62℃50s，72℃1min，35个循环；72℃5min；12℃保存；当采用所述(b)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，用于扩增所述待测等位基因的引物对为所述原有引物对；所述PCR扩增体系组成如下：Mg2+浓度为5.5mM的1×PCR扩增缓冲液，终浓度为200μM的dNTP，终浓度为0.2μM的所述上游引物BF和所述下游引物BR，终浓度为0.075U/μl的DNA聚合酶，基因组DNA，余量为水；所述PCR扩增反应程序如下：96℃3min；96℃25s，65℃50s，72℃1min，35个循环；72℃5min；12℃保存；当采用所述(c)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，所述上游引物BF的序列为序列表中序列3；所述PCR扩增体系组成如下：Mg2+浓度为2.5mM的1×PCR扩增缓冲液，终浓度为200μM的dNTP，终浓度为0.2μM的所述上游引物BF和所述下游引物BR，终浓度为0.075U/μl的DNA聚合酶，基因组DNA，余量为水；所述PCR扩增反应程序如下：96℃3min；96℃25s，65℃50s，72℃1min，35个循环；72℃5min；12℃保存。