[发明专利]一种人体抗AQP4自身抗体检测材料及其制备方法

摘要

本发明提供了一种人体抗AQP4自身抗体检测材料及其制备方法，先获取M1、M23亚型的AQP4全长目的基因，将其染入HEK293细胞中，构建出表达M1、M23亚型AQP4的HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞；再提取上述细胞中的AQP4‑细胞膜复合物；最后将AQP4‑细胞膜复合物固化在载体上，即得到人体抗AQP4自身抗体检测材料。本发明以提取的AQP4‑细胞膜复合物作为检测材料，可以减低造成背景着色的内源蛋白量，较目前使用细胞为检测材料进行的免疫荧光检测的方法进一步增加了检测灵敏度和特异性，使检测结果判读更加容易明确，能够简便快速的用于检测患者AQP4自身抗体。

主权项

1.一种人体抗AQP4自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获取M1、M23亚型的AQP4全长目的基因，通过pCI‑neo质粒载体将目的基因分别转染入HEK293细胞中，构建出表达M1亚型AQP4基因的HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和表达M23亚型AQP4基因的HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞；2)提取HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞的AQP4‑细胞膜复合物；3)将提取的AQP4‑细胞膜复合物固化在载体上，得到人体抗AQP4自身抗体检测材料；步骤2)的具体步骤为：首先通过离心分别去除HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞的细胞核，然后加入去垢剂，4℃作用30～60分钟，再离心去除未溶解部分，上清即为可溶性的AQP4‑细胞膜复合物；其中去垢剂为5～20mmol/L的CHAPS或体积分数为0.5～1％的Triton X‑100；或者步骤2)的具体步骤为：先通过物理研磨、超声或低温冻融分别使HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞的细胞膜破碎，释放细胞胞浆内容物，然后离心，弃上清胞浆蛋白，向得到的沉淀中加入高渗溶液，4℃作用15～30分钟，再次离心，弃上清胞核蛋白，最终得到的沉淀即为不可溶性的AQP4‑细胞膜复合物；所述高渗溶液由Tris‑HCl、NaCl、MgCl2和EDTA配制而成，高渗溶液中Tris‑HCl的浓度为20mmol/L、NaCl的浓度为300mmol/L、MgCl2的浓度为2mmol/L、EDTA的浓度为2～5mmol/L，高渗溶液的pH＝8；或者步骤2)的具体步骤为：先通过物理研磨、超声或低温冻融分别使HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞的细胞膜破碎，释放细胞胞浆内容物，然后离心，弃上清胞浆蛋白，向得到的沉淀中加入Dextran‑PEG‑Na3PO4液体二相混合液，再次离心，然后静置，形成二个液态相，上部液态相中即含有AQP4‑细胞膜复合物；所述Dextran‑PEG‑Na3PO4液体二相混合液由Dextran、PEG和Na3PO4配制而成，Dextran‑PEG‑Na3PO4液体二相混合液中Dextran的体积分数为20％，PEG的浓度为1.03g/mL，Na3PO4的浓度为0.2mol/L，Dextran‑PEG‑Na3PO4液体二相混合液的pH＝6.5。