[发明专利]一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，具体步骤为包被瓶制备包被瓶置4℃冰箱中保存备用；皮肤干细胞制备取脸颊或下巴皮肤组织，去除脂肪组织；组织块置于无菌平皿中，过夜消化；对真皮层小块消化；将上述细胞悬液用过滤器过滤；留用贴壁细胞；培养箱中培养；用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落；将上述细胞按13的比例分瓶传代，继续培养，细胞传至2‑5代，即可。本发明具有细胞得率高、分化效率高等优点。

主权项

一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤为：一、包被瓶制备：(1)、将人Ⅳ型胶原溶解并用PBS稀释至0.1g/L制成包被液；(2)、取5ml包被液加入培养瓶中，平放，置4℃冰箱中过夜；(3)、弃上清，置于超净工作台中干燥；(4)、包被瓶置4℃冰箱中保存备用；二、皮肤干细胞制备：(5)、取脸颊或下巴皮肤组织，去除脂肪组织；(6)、将皮肤切成0.5mm×0.5mm的小块，用PBS冲洗三次；(7)、组织块置于无菌平皿中，真皮面朝下，用含有1U/ml中性蛋白酶Ⅱ的消化液，4℃，过夜消化；(8)、用眼科镊子分离表皮，并弃之，然后将真皮层切成1mm3的小块；(9)、用含体积分数为0.5％Ⅰ型胶原酶的消化液，于37℃，对真皮层小块轻摇消化1h；(10)、再加入等量的DMEM/F12培养基，终止消化，再将细胞悬液以180g离心10min；(11)将上述细胞悬液用过滤器过滤，去除残余的组织块，调整细胞密度为1×105/ml；(12)、将上述细胞悬液接种于包被有Ⅳ型胶原的T25培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中，贴壁10‑20min后，吸弃上清液，留用贴壁细胞；(13)、再向T25培养瓶中加入10ml细胞培养液，置于37℃、5％CO2的饱和湿度的培养箱中培养，每2‑3天换液一次；(14)、细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；(15)、培养瓶内加入体积分数为0.25％胰蛋白酶消化液+0.01％EDTA，置于37℃，5％的CO2温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml细胞培养液终止消化；(16)、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液180g离心，5min；(17)、将上述细胞按1:3的比例分瓶传代，继续培养，细胞传至2‑5代，即可。