[发明专利]一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法

摘要

本发明提供一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，主要内容包括：制备重组表达载体pET‑22b‑HUβ‑Lfb和pET‑22b‑HUβ’‑Lfb，将构建好的重组载体分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后过夜培养，菌液接种到LB培养液中，摇床培养，然后加入IPTG，并放入摇床中；筛选到所释放的蛋白为水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株，最后通过裂解透析洗脱并高温加热等操作得到HU‑Lfb和HUβ’‑Lfb蛋白原液。本发明可以简化融合蛋白的设计及纯化方法，避免了融合蛋白设计Linker的繁琐步骤，并利用其耐高温特性简化了纯化该融合蛋白的方法。

主权项

1.一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建重组表达载体pET‑22b‑HUβ‑Lfb；2)构建重组表达载体pET‑22b‑HUβ’‑Lfb；3)将构建好的重组载体pET‑22b‑HUβ‑Lfb和pET‑22b‑HUβ’‑Lfb分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后取含重组质粒的阳性菌株并加入LB液体培养基中过夜培养，接着菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6～0.8；然后加入异丙基硫代半乳糖苷，并放入37℃摇床中诱导表达5小时，摇床转速为180rpm；4)取诱导表达后的菌液经3000×g离心15min得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS‑PAGE电泳检测蛋白表达情况，从而筛选到所释放的蛋白具有水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；5)将获得的阳性菌液经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于‑70℃冷冻放置过夜，备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液B‑PER中，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入体积比10％的PEI至终浓度为体积浓度0.35％和终浓度0.75M的NaCl，4℃放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50％，在4℃放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液A，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2M和0.25M的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及0.25M NaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液，将原液进行90℃加热20min后以转速14000×g，4℃下离心20min取上清液即得融合蛋白溶液；加入甘油至其体积分数为50％，‑70℃保存待用。