[发明专利]一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法

摘要

本发明公开了一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法，本发明是以油橄榄叶为原料，经30～50％乙醇提取、陶瓷膜和超滤膜分离，纳滤膜浓缩，制备油橄榄多酚提取物。将90％羟基酪醇与10～40％橄榄苦苷提取物及90％毛蕊花苷复配，制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物，以羟基酪醇和毛蕊花苷多酚为模型材料，由卵磷脂、胆固醇、吐温‑80表面活性剂等组成制成相应的脂质体。此脂质体显著增强油橄榄多酚提取物的生物利用度，包封率高，粒径分布均匀，稳定性好，有缓释性、抗氧化性和抑菌性作用。本发明的制备方法简单可行，设备简单，可扩大其医药领域的应用。

主权项

一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：第一步：油橄榄多酚提取物制备取油橄榄叶，加入30～50％乙醇提取，油橄榄叶与30～50％乙醇质量体积比(kg∶L)1∶5～20，提取两次，温度70～85℃，合并提取液，滤液过陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000Da超滤膜，再用纳滤膜浓缩滤液，滤液过纳滤膜，橄榄叶与浓缩滤液质量体积比(kg∶L)1∶1～3，浓缩液真空干燥，粉碎成粉制成油橄榄多酚提取物，HPLC分析，其中橄榄苦苷10～40％，毛蕊花苷3～6％，羟基酪醇2～7％，水溶性为100mL水溶解2～8g；第二步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备将90％羟基酪醇与10～40％橄榄苦苷提取物及90％毛蕊花苷复配，按质量比例为4～8∶2～5∶1～3，加入3～8倍无水乙醇，60～90℃加热回流10～30min，样品充分溶解后过滤，减压浓缩，制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物，其中羟基酪醇为50～70％，橄榄苦苷为10～20％，毛蕊花苷为5～15％；第三步：薄膜分散‑机械振荡法制备长循环油橄榄多酚脂质体以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标，设计温度40～70℃、卵磷脂与胆固醇质量比为1∶1～8∶1，称卵磷脂与胆固醇质量3～10g，表面活性剂吐温‑80体积2～10mL，PEG200 1～5g，放入圆底烧瓶中，加入适量有机溶剂，超声振荡5～20min，溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂，再加入1～4mg/mL羟基酪醇(HT)水溶液1～10mL，油橄榄多酚水溶液1～3mL，旋转洗膜水化时间5～50min，再超声溶解5～30min可得到脂质体。根据单因素与正交设计优化，制备均匀的乳白色长循环脂质体，具有稳定性、缓释性、抗氧化性和抑菌性等功能；第四步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率取脂质体于烧杯中，加入去离子水，脂质体与去离子水质量体积比浓度为2～15mg/mL，放入透析袋中，在室温下透析1～15h，HPLC分析水溶性中HT浓度(C)和透析滤液中HT浓度(C0)，HT水溶性体积(V)，透析滤液的总体积(V0)，根据下式计算富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率为20～80％以上；第五步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体平均粒度及其分布将1～10mg/mL脂质体放入比色皿中，加入一定量的去离子水，用ZetaPlus型激光粒度仪在光源波长368nm和散射角90°下室温测试，制备的脂质体的粒径分布在200～1000nm。第六步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性1.物理稳定性：取1～8mg/mL脂质体悬浊液和相同浓度HT水溶液，分别用4 000r/min～10 000r/min离心机离心10～20min，制备的脂质体在4 000～6000r/min无沉淀和不分层，乳液稳定；于4℃～25℃下贮藏0～30d，脂质体中羟基酪醇和毛蕊花苷稳定，相同条件下比HT水溶液中HT稳定性提高20～40％；2.水解稳定性：在薄膜分散‑机械振荡法制备脂质体悬浮液，在pH值为3.0～7.0的柠檬酸缓冲液(0.1～0.5mol/L柠檬酸溶液与0.2～0.5mol/L磷酸氢二钠溶液)，分别测定各脂质体的包封率，结果是，随着水化液pH值的升高，包封率增加。第七步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的缓释性配制HT浓度为1～8mg/mL脂质体悬液，移取悬液1～5mL放入透析袋内，将其完全浸入含有100mL生理盐水的烧杯中；将烧杯放入37℃恒温的水浴锅内，在24h内每间隔2h分析透析滤液中HT浓度。与相同浓度HT水溶液作对照，HT水溶液2h内释放了(43.66±1.82)％，脂质体释放了(28.62±1.87)％；24h后，HT溶液和脂质体释放分别为(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同条件下脂质体提高30～65％的缓释性能。第八步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抗氧化性将脂质体悬液和HT水溶液样品分别配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/mL的无水乙醇待测溶液。1mL待测样品加入40mg/L DPPH醇溶液3mL，充分混匀后，室温下避光反应30min，在517nm波长下测定吸光度(Ai)。每个样品平行3次，取平均值。经计算得知HT脂质体的IC50为0.5～2μg/mL，为HT水溶液和脂质体对DPPH自由基清除效果大体一致。说明利用脂质体技术把HT制备成相应脂质体后，它对DPPH自由基的清除效果并没有受到影响。样品溶液对DPPH自由基清除率(η)的计算公式如下：η=1-(Ai-A0)A1×100%]]>式中：A0——1mL待测样品与3mL无水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；A1——1mL无水乙醇与3mL DPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值(自由基总值)；Ai——1mL待测样品与3mLDPPH醇溶液混合反应30min后的吸光值。第九步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抑菌性采用菌体浓度为105cfu/mL的菌悬液配制脂质体悬液和HT水溶液样品浓度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL的样品溶液。将上述配好的溶液放置恒温恒湿培养箱内，37℃培养24h后观察结果，试管中几乎无浑浊现象对应的样品浓度作为此样品的MIC值。每种样品做3个平行测试。在MIC测定结果的基础上，选取未见细菌生长的各管培养液，移取0.1mL涂布于固体培养基上，放置37℃培养箱内，24h后观察结果，仍无细菌生长现象对应的样品浓度作为此样品的MBC值。相对于HT水溶液，脂质体的抑菌效果相当，且对金黄色葡萄球菌的MIC为4～16μg/mL，MBC值为16～64μg/mL。对大肠杆菌的MIC为16～64μg/mL，MBC值为32～128μg/mL。