[发明专利]一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法

摘要

本发明涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法。所述的配对微流控芯片为高通量捕获单微球/单细胞的微流控芯片，所述的方法包括：a、高通量配对捕获单微球/单细胞；b、对配对单元平行操控，如对大量单细胞的隔离、培养、裂解等，单细胞各种内含物的捕获等；c、通过编码微球将单细胞内含物信息转化为DNA序列信息，利用高通量测序技术和生物信息学方法分析大量单细胞内含物，如转录组、基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。本方法可以全面完整的分析单细胞内含物信息，具有通量高，准确性高，成本低，可分析靶标广等优点。

主权项

1.一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括如下步骤：首先提供一微流控芯片，该微流控芯片包括捕获层、控制层、载片三部分；捕获层包括两个并行的流道（10，11）和连接通道（13），控制层包括隔离通道（12）；其中每个捕获通道由多个捕获单元（8，9）首尾串接而成，每个单元包括流道（10，11）、储液腔室（14，15）、捕获通道（16，17）三部分，流道（10，11）包括U形管，前一单元U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，储液腔室（14）位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管的液体进口端，第二通道为捕获通道，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往Ｕ型管的液体出口端；第三通道为连接通道（13），直径小于捕获的单微球/单细胞，通往并行的另一捕获单元的储液腔室；连接通道（13）连接两个捕获单元的储液腔室（14，15）；隔离通道（12）层位于连接通道（13）下方或上方，垂直于连接通道（13）并由隔膜（18）隔离开；两个流道分别含有一个样品入口（1，2）、一个油相入口（4，5）以及一个出口（6，7），隔离通道含有一个入口（3）；a、在隔离泵入口（3）注满溶液，增加注射泵压力，隔离通道（12）形变，隔膜（18）挤压连接通道最上层，直到连接通道（13）被完全阻断开，从通道入口（1）用注射泵通入细胞悬浮液，各捕获单元（8）捕获单细胞；b、保持连接通道（13）关闭状态，在微球通道入口（2）用注射泵通入微球悬浮液，在并行的另一个微球通道中实现高通量单微球的捕获；c、保持连接通道（13）关闭状态，分别细胞通道入口（1）和微球通道入口（2）通入清洗溶液，洗去通道中残余的细胞和微球；d、保持连接通道（13）关闭状态，细胞通道入口（1）继续通入清洗溶液或者反应溶液A，在微球通道入口（2）通入细胞裂解液或者反应溶液B，将微球通道和捕获腔室的清洗溶液替换为相应的反应溶液；e、保持连接通道（13）关闭状态，将细胞入口（1）打开，关闭出口（7），在入口（4）用注射泵通入油相，储液腔室内形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中；f、保持连接通道（13）关闭状态，将微球入口（2）打开，关闭出口（6），在入口（5）用注射泵通入油相，储液腔室形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，形成独立的反应单元；g、关闭隔离泵，此时连接通道（13）被打开，此时并行通道中包裹微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室（15）里面的细胞裂解液或者反应溶液B扩散到细胞储液腔室（14）将细胞裂解，释放单细胞中的内含物，且内含物通过扩散作用进入微球捕获腔室，与反应溶液A和微球一起充分接触后被捕获或者反应，单细胞中的内含物反应后被微球全部捕获，完成所有单微球对与其配对的单细胞的内含物的单独捕获；h、打开细胞通道出口（7）和微球通道出口（6），再从两个通道入口（1，2）分别通入洗涤溶液，将未被捕获的其他物质洗去；将捕获层与控制层剥离开，回收捕获通道中的微球，然后再次用洗涤溶液清洗微球，进一步除去溶液中未结合的其他物质；i、配制连接酶反应溶液，将微球分散在酶反应溶液中，将微球上的编码信息与所捕获的内含物通过酶反应连接在一起形成编码内含物信息，用洗涤溶液对清洗完成酶反应的微球进行洗涤；j、外切酶切割：配制核酸外切酶I反应溶液，将经过酶反应的微球分散在核酸外切酶I反应溶液中反应，切割去掉多余的单链编码引物，保留编码内含物信息，然后用洗涤溶液洗涤微球，将微球分散在缓冲溶液中；k、建库测序：配制PCR反应溶液，将微球分散在PCR反应溶液中对编码内含物信息进行PCR扩增，微球上的编码内含物信息被扩增到溶液中，对扩增产物进行纯化并定量；用纯化后的扩增产物进行DNA文库构建并测序；l、生物信息学分析：分析得到的高通量测序结果，根据编码分析物信息对单细胞中的内含物进行定量分析，绘制针对内含物的单细胞分子生物学图谱。