[发明专利]一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的方法

摘要

本发明属于生物技术邻域，涉及一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的基因改良技术方法。该方法创制了种子特异性表达启动子napin A控制的FAD2、FAE1单基因以及双基因RNA干涉材料，FAD2‑Ri、FAE1‑Ri 及FAD2/FAE1‑Ri。虽然这些干涉材料显示了显著降低的FAD2、FAE1基因表达，然而生长和发育过程却没有受到影响。抑制的FAD2、FAE1基因表达修饰了菜籽油的脂肪酸图谱，导致干涉材料种子中油酸含量显著增加和芥酸含量极显著的降低。于此结果相一致，转基因菜籽油C18不饱和脂肪酸中C181/C182和C181/C183比例有很大程度的提高。除此以外，降低的FAD2、FAE1基因表达还导致油菜籽蛋白含量一定程度的增加。

主权项

一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）质粒构建1.1）种子特异性的RNA干涉载体构建，用引物（F: GAA TTC CAG GTC TAA GCT TTC TTC，R:GTC GAC TTG TTT GTA TTG ATG AGT）将napin A启动子从CY2基因组中扩增，并在EcoRI/XhoI位点克隆到pFGC5941载体中，获得pFGC5941NapinA构建；1.2）BnFAE1干涉载体构建步骤如下：440bp的BnFAE1片段用BnFAE1 F1: CCA TGG ATC CAA CAA GCC TGG AGA TC和BnFAE1 R1: CTC GAG TCT AGA TGA AGT GTT TCC AAA TC引物进行扩增；然后从BamHI/XbaI 或 NcoI/XhoI 两个位点按相反方向插入pFGCNapinA载体，两个片段由矮牵牛查尔酮合成酶内含子分隔开以形成发夹结构，构成的BnFAE1干涉载体；1.3）BnFAD2干涉载体构建步骤如下：508bp的 BnFAD2片段用BnFAD2 F1：CACCATGGATCCTGGAAGTACAGTCAT 和BnFAD2 R1：GTGTCGACTCTAGATTC CGTAGTCTCTGT引物进行扩增；然后从BamHI/XbaI 或 NcoI/SalI 两个位点按相反方向插入pFGCNapinA载体，两个片段由矮牵牛查尔酮合成酶内含子分隔开以形成发夹结构，构成的BnFAD2干涉载体；2）转基因植株的产生干涉载体被转进农杆菌EHA105以供下一步转化；受体亲本CY2种子灭菌后接种在不含激素的1/2MS培养基上发芽和培养，5‑7天后从无菌苗切下下胚轴并剪成0.8cm长的小段，作为外植体用于携带BnFAE1干涉载体和BnFAD2干涉载体的农杆菌EHA105的介导转化；转化植株用20mg/L草丁膦进行筛选，筛选出的PPT抗性苗生根后在温室盆钵中驯化一段时间后移栽于大田；转基因植株转移到土壤中进一步生长，同时提取候选株系的DNA用于转基因的PCR探测，用于转基因探测的PCR引物分别为BnFAE1 F1: CCA TGG ATC CAA CAA GCC TGG AGA TC 和OCS R：GCGATCATAGGCGTCTCGCAT；BnFAD2 F1：CACCATGGATCCTG GAAGTACAGTCAT和OCS R：GCGATCATAGGCGTCTCGCAT；4）实时定量qRT‑PCR分析各种基因型发育的种子取样，提取RNA，合成cDNA；为了分析BnFAD2和BnFAE1基因的表达，实时定量PCR用于分析BnFAD2和BnFAE1基因的mRNA表达水平；Actin用作内部对照，引物为Actin F: ACGAGCTACCTGACGGACAAG，Actin R：GAGCGACGGCTGGAAGAGTA；分析BnFAD2表达的引物为BnFAD2 F2: CGATCCCTCGCTCTTTCTCCT，BnFAD2 R2: GGGACGAGGAG GAAGGAGTGG；分析BnFAE1表达的引物为BnFAE1 F2: TCTCCGCGATG GTCGTTAACACTT，BnFAE1 R2: TCCTTGGACAAACTCACT CCGGTT；以SYBR Green I为染料的PCR扩增程序为：95℃，1min；95 ℃，15sec，60 ℃，45sec ，40cycles；5）FAD2‑Ri 和 FAE1‑Ri 干涉株系的杂交为了获得BnFAD2和BnFAE1双基因干涉株系，通过步骤4）所述的qRT‑PCR分析分别检测BnFAD2和BnFAE1基因的表达获取代表性的基因干涉效果良好的FAD2‑Ri 和 FAE1‑Ri 干涉株系；然后进行FAD2‑Ri 和 FAE1‑Ri 干涉株系的杂交，获取F1种子，F1种子种下去后获得F2群体；在F2群体所有可能的基因型中通过步骤4）所述的qRT‑PCR分析，获得干涉效果良好的FAD2/FAE1‑Ri双基因干涉株系。