[发明专利]一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法在审
| 申请号： | 201710232811.8 | 申请日： | 2017-04-11 |
| 公开（公告）号： | CN108690867A | 公开（公告）日： | 2018-10-23 |
| 发明（设计）人： | 王婷;约瑟夫.弗戈迈尔;刘丽 | 申请（专利权）人： | 南京农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/34 | 分类号： | C12Q1/34 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 徐冬涛;杜静 |
| 地址： | 211225 江苏省南京市溧*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种N‑糖酰胺酶活力测定的方法，包括如下步骤：(1)还原糖标准曲线的制备，(2)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应，(3)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定；并进一步优化了显色条件。本发明所公开的方法准确度高、重复性强、操作简便、适用于大规模筛选N‑糖酰胺酶的活性。 | ||
| 搜索关键词： | 糖酰胺酶 水解糖蛋白 大规模筛选 酶活力测定 准确度 标准曲线 产物测定 活力测定 显色条件 还原糖 底物 制备 优化 | ||
【主权项】：
1.一种N‑糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)还原糖标准曲线的制备：将还原糖标准品稀释成一系列的浓度标准液，于各浓度标准液中加入三氯乙酸溶液、氢氧化钠溶液、WST‑1显色溶液，混匀后40‑60℃显色50‑60min，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线；(2)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应：将糖蛋白标准品用水稀释，加热变性，冷却后加入pH缓冲液和不同浓度的N‑糖酰胺酶反应；(3)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定：步骤(2)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白反应液中加入三氯乙酸溶液终止反应，离心取上清液；加入氢氧化钠溶液，再加入WST‑1溶液40‑60℃显色50‑60min小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，反应零分钟为空白对照；根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N‑糖酰胺酶酶解产物浓度，从而计算酶活性。
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