[发明专利]重组人皮肤桥蛋白成熟肽段及其生产方法

摘要

本发明公开了一种重组人皮肤桥蛋白(dermatopontin,DPT)成熟肽及其生产方法，所述生产方法如下获得人DPT成熟肽段基因；构建真核表达载体并将其转化到毕氏酵母X‑33中；抗性筛选高水平分泌表达的酵母转化子；诱导表达上清经镍柱纯化，得rhDPT。该方法制得的重组蛋白rhDPT带有HIS及C‑MYC标签，易于蛋白纯化和检测，此外在体外实验中rhDPT可有效抑制脂肪细胞的生长，具有良好的生物活性。

主权项

一种重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备质粒rhDPT/pMD‑20T：获得碱基序列如SEQ ID NO.1所示的人DPT基因，将所述人DPT基因连接到pMD‑20T载体，得质粒rhDPT/pMD‑20T；(2)构建重组载体pPICZαA/DPT：将pPICZαA原始载体和所述质粒rhDPT/pMD‑20T分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，再纯化回收，将回收的pPICZαA载体基因片段与rhDPT基因片段用solution Ⅰ DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/DPT；(3)转化重组载体至真核酵母宿主中：将所述重组载体pPICZαA/DPT用Sac Ⅰ单酶切线性化，再转入毕氏酵母X‑33宿主中，再经过含zeocin的YPDZ平板筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：将所述阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性酵母转化子，再用BMGY培养基培养，甲醇诱导，得高水平分泌表达酵母转化子；(5)纯化：用镍亲和层析柱对rhDPT进行纯化，得重组蛋白rhDPT。