[发明专利]提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法

摘要

本发明公开了提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法。发明人通过大量的研究，发现通过富集母体外周血中的<160bp的某一点或者任一区段长度的游离DNA进行测序和数据分析，可以出人意料地富集母体外周血中胎儿的游离DNA，从而将胎儿游离DNA浓度(百分比)提高至原来的1.5～4倍。孕妇外周血中胎儿游离DNA的浓度均值为13％，本发明的装置和方法可将胎儿游离DNA浓度均值提高至20％～40％，效果显著。通过有效提高胎儿游离DNA浓度，可以大幅减少高通量测序的数据处理量，有利于进一步降低高通量测序的成本。

主权项

1.一种从母体外周血中获得高浓度胎儿游离DNA的方法，包括如下操作：1)从母体外周血中分离血浆并提取其中的游离DNA；2)通过构建文库对游离DNA进行扩增，具体操作为：末端修复：将上一步提取获得的游离DNA 分别按照下面的表格配置反应体系；将此反应体系置于室温孵育20min；使用AMPure XP磁珠进行纯化，25μL TE溶液溶解洗脱；接头连接：将上步所得的平末端DNA分别按照下面的表格配置反应体系：所述P1接头为由如下两个正反序列组成的P1 Adapter：5'‑CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT‑3'，3'‑T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA‑5'所述标签序列X是由如下正反两个序列组成的Barcode Primer X组成：5'‑CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT‑3'3'‑CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA‑5'其中“N”代表A、T、C、G任意一个碱基； *代表核苷酸进行了硫代修饰，防止被核酸酶降解；将此反应体系置于室温孵育30min；使用AMPure XP磁珠进行纯化，18.2μL TE溶液溶解洗脱；PCR扩增：将上步所得的连接接头的DNA按照下面的表格配置反应体系所述PCR引物序列为：Primer 1：5 ' ‑CCATCTCATCCCTGCGTGTC‑ 3 'Primer 2：5 ' ‑CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG ‑3'PCR 反应条件： 72℃， 10min， 95℃， 5min；然后 95℃， 15s， 62℃， 15s， 70℃，1min， 12 个循环； 70℃， 5min； 4℃， holding；PCR结束后，用AMPure XP磁珠进行纯化，30μL TE溶液溶解洗脱；3)及文库片段筛选，具体包括：a)将进行筛选的文库DNA 加入1.5倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；b)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，将上清和磁珠充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；c)吸走上清，使用75%～80%乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库；或a)将进行筛选的文库DNA 加入1倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；b)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；c)吸走上清，使用75%～80%乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库；其中，所述文库片段筛选用于富集游离DNA中片段长度区段为 [115‑125)、[105‑125)、 [115‑135)或[105‑135)的游离DNA片段。