[发明专利]一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法

摘要

本发明是一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法，包括突变体克隆构建，所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；然后进行突变体的筛选将野生型pET28b‑M‑MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞中，培养、诱导突变酶表达；收集菌体获得突变酶粗提液；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养、诱导蛋白表达；收集菌体纯化得到M‑MLV逆转录酶。本发明方法采用分子理性设计与功能筛选相结合，在较小范围内筛选即获得高热稳定性M‑MLV逆转录酶，其热稳定性达到耐热能力65°C。

主权项

一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，其步骤如下：（1）突变体克隆构建：野生型M‑MLV逆转录酶的基因序列CCA64130.1通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57‑M‑MLV质粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点；pUC57‑M‑MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M‑MLV逆转录酶基因的片段以T4 DNA Ligase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET‑28b载体上，使M‑MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b‑M‑MLV，并经测序确认序列正确；该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M‑MLV逆转录酶；逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b‑M‑MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KOD Site‑Directed Mutagenesis Kit定向引入点突变；每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；（2）突变体的筛选：将编号分别为1‑18的野生型pET28b‑M‑MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的平板上以30℃－40℃条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB液体培养基中，在30℃ ‑40℃、150rpm－250 rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4－0.6，再加入终浓度为0.1－0.3 mM的诱导剂IPTG在16℃下以150rpm－250 rpm摇动培养，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液离心收集菌体；菌体以B‑PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，静置，涡旋后低温离心取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS‑PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1 µg RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)20引物、4 µl 5X M‑MLV First Strand Buffer、1 µl 0.1 M DTT、1 µl Ribonuclease Inhibitor、1 µl dNTP Mix，以及0.5 µl突变酶粗提液，用Nuclease‑free Water将总体积补至20 µl，在37℃－60℃不同反应温度下反应；反应结束后，于80℃－90℃孵育5s－15 s以终止反应，使用0.5 µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1对β‑Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性；（3）逆转录酶突变体的表达与纯化：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6‑0.8，加入终浓度为0.15mM－0.25 mM的IPTG，在15℃－17℃，180rpm－220rpm培养10－20小时，诱导蛋白表达；将IPTG诱导后的发酵液以8000g离心15－25min收集菌体；菌体以Ni柱结合缓冲液充分重悬后，以细胞高压破碎仪破碎，再以43000g低温离心20－40 min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS‑PAGE电泳检测；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液、漂洗缓冲液和梯度洗脱缓冲液；Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液，储存于‑80°C；整个纯化过程在冰上或4°C进行；得到M‑MLV逆转录酶。