[发明专利]一种基于81°‑TFG的NDV免疫传感器的制作方法及检测方法

摘要

本发明提供一种基于81°‑TFG的NDV免疫传感器的制作方法，包括如下步骤NDV F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定；81°‑TFG 的表面修饰；表面处理，最终构成对NDV抗原具有特异性检测能力的81°‑TFG免疫传感器。采用本方法制备的81°‑TFG免疫传感器，充分利用其高RI灵敏度、极低的温度敏感系数及很窄的共振带宽，能够克服基于长周期光纤光栅（LPFG）或小角度倾斜光纤光栅的免疫传感器存在的问题。利用“葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A,SPA）”将高特异性的“NDV单克隆抗体”固定在81°‑TFG表面，用于对NDV进行特异性的结合，极大提高免疫传感器的灵敏度、稳定性及特异性。相对于传统的PCR技术、酶联免疫等生化检测等方法，具有免标记、操作简便、快速检测等优点。

主权项

一种基于81°‑TFG的NDV免疫传感器的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：1）NDVF蛋白单克隆抗体的制备及鉴定将已构建的含有NDVF蛋白基因的重组表达载体阳性菌进行诱导表达，表达产物经镍柱亲和层析纯化，以此蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG‑1500进行细胞融合，建立间接ELISA，用于筛选阳性克隆，采用体内诱生法制备单抗腹水，并使用Protein A柱纯化腹水中的抗体；2）81°‑TFG的表面修饰在免疫传感器表面修饰中使用SPA蛋白，均匀分布在金黄色葡萄球菌细胞壁表面上，通过羧基端（‘‑COOH’）与细胞壁肽聚糖呈共价连接；SPA多肽链由A、B、C、D四个同源区组成，每个同源区都能与人及多种哺乳动物血清中IgG的‘Fc位点结合’，而且不会封闭抗体上能与抗原结合的‘Fab活性位点’，并能使Fab的活性位点片段裸露在修饰膜的外层而伸向流动相；表面修饰方法如下：HNO3溶液（5%）浸泡81°倾斜光栅1‑1.5h，然后用去离子水和无水乙醇清洗光栅表面3‑5次并晾干；将光栅晾干后置于洁净的玻璃器皿内，加入H2SO4（98%H2SO4：30%H2O2=5：1现配现用）浸泡1‑1.5h后，70℃连续烘干过夜，以激活在光栅表面激活羟基（'‑OH '）；在干燥环境下用硅烷偶联剂APTES（10%，无水乙醇配置）浸泡光栅40min以在光栅表面生成氨基基团（‘‑NH2’），用去离子水和无水乙醇清洗清洗光栅表面5‑7次并晾干；3）表面处理方法使用浓度为0.1mg/ml 的NDV‑MAb溶液（0.01M，pH7.4 PBS配制），浸泡经过SPA修饰的81°倾斜光栅40min，在此孵化过程中，NDV‑MAb的'Fc位点'将与SPA分子的多肽链相连接；再使用PBS冲洗上述81°倾斜光栅表面3‑5次以去除光栅表面未结合的NDV‑MAb分子，最终构成对NDV抗原具有特异性检测能力的81°TFG免疫传感器。