[发明专利]肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法与应用

摘要

本发明公开了肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法与应用，构建含NXP2 N端(1‑500aa)或NXP2 C端(400‑939aa)带有Myc标签的质粒pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C，用待测肌炎患者的血清作为一抗、兔抗人IgG H&L作为二抗确定肌炎患者血清中是否具有NXP2自身抗体；解决了目前国内还没有商业化的检测NXP2抗体的ELISA试剂盒以及免疫印迹膜条的问题，以及自行包被NXP2抗原的ELISA试剂盒的高成本、高假阳性率和放射标记免疫沉淀法的安全性等问题。

主权项

肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用引物对NXP2‑F/NXP2‑R2和引物对NXP2‑F2/NXP2‑R从pCMV‑myc‑NXP2全长质粒中分别PCR扩增人NXP2的N端或C端；(2)用胶回收试剂盒(Omega,D2500‑01)回收纯化步骤(1)所述的NXP2的N端或C端，然后克隆至pCMV‑myc载体，构建含NXP2N端或NXP2C端且带有Myc标签的pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒；(3)酶切鉴定确定步骤(2)所述pCMV‑myc‑NXP2N、pCMV‑myc‑NXP2C质粒的插入子，并测序验证其NXP2N端、NXP2C端序列和读码框的准确性；(4)将步骤(3)所述验证后的pCMV‑myc‑NXP2N或pCMV‑myc‑NXP2C质粒瞬时转染人胚肾HEK293细胞48小时，通过Western Blot法分别用c‑myc抗体、NXP2抗体检测其在HEK293细胞中的过表达；(5)将步骤(4)中所述过表达NXP2N端或NXP2C端的HEK293细胞裂解液进行SDS‑PAGE凝胶电泳，分别用NXP2抗体阳性的肌炎患者血清和正常人的血清作为一抗、兔抗人IgG H&L作为二抗进行检测，证实NXP2抗体阳性血清能够特异性识别步骤(4)中所述HEK293细胞过表达的带有myc标签的NXP2N端和NXP2C端；(6)将步骤(4)中所述过表达NXP2C端的HEK293细胞裂解液进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用待测肌炎患者血清作为一抗、兔抗人IgG H&L作为二抗进行检测。