[发明专利]一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法。本发明采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、生物素和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。而且本发明制备得到的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗。

主权项

一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型病毒液按终体积1:50～1:200接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现70～80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，收集禽流感病毒H9亚型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班‑80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班‑80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，加入3～5份吐温‑80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000～16000rpm的条件下乳化4‑6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。