[发明专利]一种用于生产哌啶甲酸的重组质粒、基因工程菌株及方法

摘要

本发明公开了一种用于生产L‑哌啶甲酸的重组质粒和L‑哌啶甲酸异源合成代谢途径加强的高产基因工程菌，及哌啶甲酸的生产方法。本发明还公开了上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。高产基因工程菌构建的策略是：采用pTrc99a单质粒多基因串联表达，将L‑赖氨酸‑α‑氧化酶基因(LysoX),葡萄糖脱氢酶基因(gcd)，Pip2C还原酶基因(DpkA)，赖氨酸转运蛋白酶基因(lysQ)串联，优化各个基因前面的控制转录和翻译的调控元件，将构建的质粒pLMAIP‑05导入到敲除赖氨酸降解途径中的必须基因(cadA)的BL21(DE3)的感受态细胞中，得到一种L‑哌啶甲酸异源合成代谢途径加强的高产基因工程菌(MLPR08)。通过表达赖氨酸转运蛋白酶，提高了底物L‑赖氨酸转运至胞内的速率，缩短发酵时间，进一步促进了L‑哌啶甲酸的合成。

主权项

1.一种产L‑哌啶甲酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是过表达L‑赖氨酸‑α‑氧化酶，葡萄糖脱氢酶，Pip2C还原酶和赖氨酸转运蛋白酶的宿主工程菌；所述宿主工程菌的赖氨酸降解途径中的必须基因cadA基因被敲除或敲减；所述基因工程菌为大肠杆菌；所述基因工程菌转化重组表达载体；所述重组表达载体包含L‑赖氨酸‑α‑氧化酶基因LysoX，葡萄糖脱氢酶基因gcd，Pip2C还原酶基因DpkA和赖氨酸转运蛋白酶基因lysQ，并且所述四种酶基因序列与用于基因表达的启动子和终止序列可操作地连接；所述L‑赖氨酸‑α‑氧化酶基因来自绿色木霉(Trichodermaviride)，葡萄糖脱氢酶基因来自大肠杆菌(Escherichia coli)K12‑MG1655，Pip2C还原酶基因来自恶臭假单胞菌，赖氨酸转运蛋白酶基因来自乳酸球菌(Lactococcuslactissubsp)；所述酶基因LysoX、DpkA、LysQ根据宿主菌偏爱密码子进行密码子优化；所述重组表达载体使用如序列SEQ ID:48‑53对四种酶基因的启动子和RBS序列进行同源重组和替换；所述重组表达载体对调控所述酶基因表达的RBS进行优化，以增强所述四种酶基因的表达。