[发明专利]肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法

摘要

本发明涉及肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法，可有效解决牛肉中掺假，以保证牛肉的纯质量问题，方法是，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；制作非标混合肉的制作，将纯牛肉与非标混合肉按不同比例混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品BCA法测定蛋白含量；称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品制备动物肉多肽溶液，净化除盐，上液相色谱‑四级杆串联质谱测定，在高分辨质谱扫描、Maxquant、Sieve数据分析的基础上得到的特征多肽信息，在子离子扫描模式下，以HPLC‑Q/Exactive中筛选出带2个或3个的电荷离子为母离子进行全扫描的特征子离子对作为肉蛋白多肽标志物分析，本发明方法新颖独特，操作使用方便，准确率高。

主权项

一种肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；(2)动物肉的预处理：生肉和熟肉不做预处理，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；(3)、掺假牛肉的制备：A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉捣碎混合均匀，得非标混合肉；B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉(纯牛肉)与非标混合肉按不同质量百分比混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作为样品，分别加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，取出冷却至室温，测定吸光度值；(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作样品，分别加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，重复3次；在冰上静置后加入预冷的丙酮，震荡摇匀，静置，再离心，弃上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗涤，将固体残渣挥去溶剂；然后用尿素/碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入DTT储备液反应，然后加入IAA储备液避光反应；加入碳酸氢铵溶液，计算肉蛋白浓度，加入Trypsin，酶切过夜，取出，加入甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；(6)、净化除盐：HLB柱依次用甲醇、水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用水淋洗，使柱体保持抽干，再用甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入乙腈‑甲酸溶解残渣，涡旋混匀，超声，过滤净化除盐；(7)、上液相色谱‑四级杆串联质谱测定动物肉中特征多肽：方法是，净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱‑四级杆串联质谱测定，在高分辨质谱扫描、Maxquant、Sieve数据分析的基础上得到的特征多肽信息，LC‑MS/MS方法首先在子离子扫描模式下，以HPLC‑Q/Exactive中筛选出带2个或3个的电荷离子为母离子进行全扫描，获得特征子离子，以特征子离子对作为肉蛋白多肽标志物进行定性与定量分析，从而实现牛肉掺伪鉴别。