[发明专利]土壤细菌高通量绝对定量方法

摘要

本发明公开了一种土壤细菌高通量绝对定量方法，包括以下步骤：1)、将E.coli HTAQ‑GFP菌体，涡旋重悬于无菌水中，调节菌悬液在紫外分光光度计OD600nm＝1.0；2)、对内标菌株HTAQ‑GFP进行绝对定量，获得菌液中内标菌株E.coli HTAQ‑GFP绝对含量；3)、添加内标菌株HTAQ‑GFP菌液至土样并搅拌混匀；4)、提取土壤DNA，进行16S rRNA基因扩增子高通量测序，获得细菌群落结构分类组成信息及对应相对丰度；5)、根据内标菌株HTAQ‑GFP绝对含量及高通量测序结果中Escherichia相对丰度计算获得土壤土著细菌总量及各分类单元的绝对含量。

主权项

1.土壤细菌高通量绝对定量方法，其特征是包括以下步骤：1)、内标菌株获取：将E.coli HTAQ‑GFP菌体，涡旋重悬于无菌水中，调节菌悬液在紫外分光光度计OD600nm＝1.0；E.coli HTAQ‑GFP菌体的制备方法为将E.coli O157:H7 EDL933制成感受态细胞，热激导入绿色荧光蛋白GFP质粒Cloning vector pGFPuv；2)、内标菌株绝对定量：采用荧光显微镜或平板计数法对内标菌株HTAQ‑GFP进行绝对定量，获得菌液中内标菌株E.coli HTAQ‑GFP绝对含量；3)、添加内标菌株HTAQ‑GFP菌液至土样并搅拌混匀，搅拌时将盛土容器置于冰浴上；4)、提取土壤DNA，进行16S rRNA基因扩增子高通量测序，获得细菌群落结构分类组成信息及对应相对丰度；5)、根据内标菌株HTAQ‑GFP绝对含量及高通量测序结果中Escherichia相对丰度计算获得土壤土著细菌总量及各分类单元的绝对含量；土壤土著细菌总量(T)计算公式为Ri表示添加内标菌株处理组中Escherichia相对丰度；Rc表示未添加内标菌株对照组中Escherichia相对丰度，如土壤未使用粪肥可不设置对照组，Rc＝0；Ii为内标菌株HTAQ‑GFP绝对含量；获得土壤细菌总量后，各分类单元绝对含量等于(T+Ii)与该分类单元相对丰度的乘积。