[发明专利]一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法

摘要

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体是一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，采用胰酶联合胶原酶及中性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁获得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。本发明建立了一套分离、培养及鉴定裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得可供科学研究的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞在低氧的生理情况下的功能变化提供了可能。

主权项

一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将裸鼹鼠新生鼠骨骼肌，去掉筋膜、脂肪、皮肤等组织，用预冷的洗涤液冲洗数次后，剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，0.5％‑2％(V/V)PS双抗，0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；B、加入每克肌肉1mL组织消化液，33‑37℃消化30min，5min摇一次；所述组织消化液的组成为：D‑Hanks溶液，0.05％‑0.2％(W/V)中性蛋白酶，0.05％‑0.2％(W/V)IV型胶原酶，0.1％‑0.25％(W/V)I型胶原酶，0.08％‑0.25％(W/V)胰酶，0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％‑15％(V/V)FBS、0.5％‑2％(V/V)PS双抗、0.005％‑0.02％(W/V)Dnase I；D、细胞悬液经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞，采用培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33‑37℃、3‑5％CO2环境中培养0.5‑2h后，重复一次；所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％‑15％(V/V)FBS、0.5％‑2％(V/V)PS双抗；E、取细胞培养液及未贴壁的细胞，加入新的培养皿中，在33‑37℃、3‑5％CO2、10‑15％O2的环境中继续培养16‑36小时，此后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。