[发明专利]一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法

摘要

本发明公开了一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法。该无外源标记基因的抗PCV2转基因猪是通过将目的基因(抗PCV2 siRNA序列)与外源标记基因(Neo/EGFP融合表达基因)构建共表达载体，并通过转染、体细胞克隆等技术获得F0代抗PCV2转基因猪，并将获得的F0代转基因猪进行配种获得F1抗PCV2转基因猪，对F1代抗PCV2转基因猪进行鉴定，筛选出合适的F1转基因猪提取耳皮成纤维细胞，进行建系，并用HTNCre重组酶筛选出删除了Neo/EGFP外源标记基因的细胞系，并利用该细胞系进行体细胞克隆，最终获得无外源标记基因的抗PCV2转基因猪。该转基因猪删除了外源标记基因，减少了外源基因对转基因猪个体健康的影响，同时也可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。

主权项

一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)、构建抗PCV2表达载体，所述的载体包含目的基因抗PCV2的siRNA表达基因序列和标记基因序列；(2)、筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；(3)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，进行体细胞核移植获得F0代抗PCV2的转基因猪；(4)、将所述的F0代抗PCV2的转基因猪与母猪杂交繁育获得能稳定遗传的抗PCV2的F1代转基因猪；(5)、筛选所述的F1代转基因猪个体并进行外源基因整合位点分析；(6)、对筛选出的F1代转基因猪个体采取耳皮成纤维细胞，并进行耳皮成纤维细胞系的建立；(7)、删除细胞外源标记基因，再建立细胞单克隆，并进行体细胞克隆获得F2代无外源标记基因的抗PCV2的转基因猪。