[发明专利]一种浅黄色金针菇的选育方法

摘要

本发明公开了一种浅黄色金针菇的选育方法，包括：种菇采集、培养基制备、单孢分离、单核菌丝获取、单核菌丝极性测定、单单菌株配对杂交、双向核迁移与同核异质菌株获得、双‑单杂交与细胞质纯化、同核异质菌株生物学差异检测与可孕性验证、浅黄色金针菇菌株获取。本发明是一种基于金针菇杂交时存在的双向核迁移现象和布勒现象，通过调节不同极性单核菌株的活性和菌丝纯化，从而实现菌株间的细胞核或细胞质替换，进而选育出浅黄色金针菇品种的方法。通过本发明方法选育的金针菇菌株为浅黄色，抗逆性强。

主权项

一种浅黄色金针菇的选育方法，包括如下步骤：（1）种菇采集选取白色金针菇品种和黄色金针菇品种的典型种菇进行孢子印收集；（2）培养基制备 用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL配制PDA无菌培养基培养皿和PDA斜面培养基，所述培养皿直径90mm；（3）单孢分离 从步骤（1）制备的孢子印中用接种环勾取孢子印，采用稀释涂布的方法接种于步骤（2）制备的PDA无菌培养基培养皿中，倒置，24℃避光培养3天，在体式显微镜下挑取萌发的单个孢子转接入PDA斜面培养基中；（4）单核菌丝获取 从步骤（3）制备的PDA斜面培养基中挑取单孢菌丝，24℃避光培养8~10天，挑取少许菌丝制片，并置于显微镜下镜检，剔除有锁状联合的异核菌丝，获得单核纯单核菌丝；（5）单核菌丝极性测定 采用常规单单杂交的方法，依据单核菌丝间配对杂交线是否有锁状联合，对挑取的无锁状联合的菌丝进行极性测定，通过多轮配对最终分别获得白色和黄色金针菇品种的4个不同极性类型的单核菌丝；（6）单单菌株配对杂交 首先将来源于不同双核菌株的可以配对的不同极性单核菌株接种于步骤（3）制备的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d，观察每个菌株的生长势，先将生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器转接于新的PDA培养皿一侧2/3处，24℃避光培养3~5d，再在同一PDA培养皿的另一侧用同样的工具和方法接入生长势强的单核菌株，两个菌种块间相距20‑23mm，继续培养15~20d；（7）双向核迁移与同核异质菌株获得 从步骤（6）的菌落中，分别挑取杂交菌落远离杂交线的两边菌丝置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝转接于新的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化，进而获得相应的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；（8）双‑单杂交与细胞质纯化 将步骤（7）获得的同核异质菌株和相应的单核菌株分别接种于PDA无菌培养基培养皿A中央，24℃避光培养10d后，先将培养皿A中生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器接种于PDA培养皿B的中央，24℃避光培养3~5d，再在PDA培养皿B一侧的1/3处，接入在步骤7中远离杂交线在该单核菌株一侧获得的同核异质菌株，两个菌种块间相距30‑32mm，继续培养10~15d后挑取单核菌落远离杂交线一侧的菌丝，置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝分别转接于PDA无菌培养基培养皿C的中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化，进而获得相应的细胞质进一步纯化的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；（9）同核异质菌株生物学差异检测与可孕性验证 将步骤（8）获得的同核异质菌株采用菌落形态观察和分子标记技术检测生物学差异，并将相应同核异质菌株转接于出菇培养基，进行出菇试验，进一步验证菌株的可孕性；（10）浅黄色金针菇菌株获取 选取步骤（9）出菇试验获得的同核异质菌株子实体，重复步骤（1）~（5），从而获得分别具有白色菌株的细胞核和黄色菌株细胞质的单核菌株和黄色菌株的细胞核和白色菌株细胞质的单核菌株，然后采用步骤（5）获得的单核菌丝进一步确定新获得的单核菌株的具体交配类型，并采用已建立的双向核迁移、纯化和鉴定技术，分别获得具有白色菌株细胞核和黄色菌株细胞质的白核黄质菌株，及其相应黄色菌株细胞核和白色菌株细胞质的黄核白质菌株，并依次编号，之后，对获得的白核黄质菌株和黄核白质菌株进行了菌落形态观察、分子标记鉴定和出菇试验，并测定其农艺学性状与栽培性状，进而筛选出符合生产需求的白核黄质和黄核白质的浅黄色金针菇菌株。