[发明专利]基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测MicroRNA的方法

摘要

本发明公开了一种基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测MicroRNA的方法，该方法将探针SH‑DNA与金磁微粒结合得到巯基标记的金磁微粒，将丙烯酰基荧光素、探针Acrydite‑DNA及丙烯酰胺共聚得到水溶性荧光聚合物。MicroRNA同时与水溶性荧光聚合物的DNA及SH‑DNA杂交，经磁分离、去杂交、再磁分离后，检测上清液荧光强度，荧光强度越大则MicroRNA浓度越大。本发明采用水溶性荧光聚合物实现检测信号的多级放大，同时金磁微粒的表面修饰SH‑DNA序列，实现了对杂交产物的分离，简化了检测操作。本发明方法无需对目标MicroRNA进行扩增，成本低，专业要求低，操作简单，分析速度快，选择性高、检出限低。

主权项

1.一种基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测MicroRNA的方法，该方法不包括疾病的诊断和治疗方法，其特征在于它由下述步骤组成：/n（1）设计合成探针SH-DNA和探针Acrydite-DNA/n根据目标MicroRNA的碱基序列，分别设计合成与目标MicroRNA中8～13个碱基序列互补的探针SH-DNA和探针Acrydite-DNA，其中探针SH-DNA的3’端修饰巯基，探针Acrydite-DNA的5’端修饰丙烯酰胺基，且这两条探针的碱基数目相差0～3个；当探针SH-DNA和探针Acrydite-DNA与目标MicroRNA互补后，探针SH-DNA的5′端和探针Acrydite-DNA的3′端相互毗邻，且这两条探针与目标MicroRNA互补的碱基数目之和与目标MicroRNA的碱基数目相同，同时探针SH-DNA的3’端和探针Acrydite-DNA的5’端分别带有3～5个与目标MicroRNA互补的碱基相毗邻的碱基T；/n（2）巯基标记金磁微粒/n将探针SH-DNA用磷酸三氯乙酯活化，活化后的SH-DNA与金磁微粒结合，得到巯基标记的金磁微粒；/n（3）合成DNA功能化的水溶性荧光聚合物/n以过硫酸铵和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺的混合物为引发剂，将丙烯酰胺、丙烯酰基荧光素、探针Acrydite-DNA进行无规共聚，得到DNA功能化的水溶性荧光聚合物；/n（4）荧光检测目标MicroRNA/n将步骤（2）得到的巯基标记的金磁微粒和步骤（3）得到的DNA功能化的水溶性荧光聚合物与不同浓度的目标MicroRNA标准样品进行杂交反应，经磁分离得到杂交产物，对杂交产物经去杂交、磁分离后所得到的上清液进行荧光检测，绘制荧光强度随目标MicroRNA标准样品浓度变化的标准曲线；按照该步骤检测待测MicroRNA样品的荧光强度，结合绘制的标准曲线的线性方程，即可实现对MicroRNA的定性和定量检测。/n