[发明专利]一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法

摘要

本发明涉及一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β‑葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）固体发酵产β‑葡萄糖苷酶；（2）制备粗酶液；（3）非变性凝胶电泳；（4）酶活染色；（5）提取；（6）纯化。在本发明的技术方案中，使用的菌株是土样中筛选得到厚垣镰孢霉，该菌株经过固体发酵产两种β‑葡萄糖苷酶，分子量分别为93kDa和52kDa，在生物乙醇、造纸等方面具有潜在的工业应用价值；本技术方案分离纯化步骤均在4℃下进行，操作步骤少、生产工艺简单、可以实现工业化生产且生产成本低，纯化效率高。

主权项

一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β‑葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）固体发酵产β‑葡萄糖苷酶：将筛选得到的厚垣镰孢霉HML278通过生理盐水制成孢子液，并将孢子液转入以甘蔗渣和麸皮为碳源的固体培养基中固态发酵，产含β‑葡萄糖苷酶的培养物；（2）制备粗酶液：将步骤（1）制得的培养物加入200‑250 mL无菌ddH2O，30℃‑50℃恒温水浴1‑3h浸提，四层纱布过滤，5000‑7000 r/min离心5‑15 min得到粗酶液，收集上清酶液2℃‑6℃保存备用；（3）非变性凝胶电泳：在2℃‑6℃条件下，用步骤（2）中收集到的上清酶液在分离胶质量分数为5%‑10%、浓缩胶质量分数为2%‑8%、恒定电压为30V‑100V的条件下进行非变性凝胶电泳22h‑25h，得到含β‑葡萄糖苷酶的凝胶；（4）β‑葡萄糖苷酶活性染色：在2℃‑6℃条件下，剪切步骤（3）中含β‑葡萄糖苷酶的凝胶得到凝胶胶条，对该凝胶胶条活性染色，活性染色液为质量分数为0.1%的七叶苷和质量分数为0.03%的三氯化铁，在25℃‑35℃下反应3 min‑10 min，凝胶胶条中含有β‑葡萄糖苷酶活性的蛋白催化底物产生黄黑色产物，以该染色凝胶胶条为导向，可确定步骤（3）中电泳凝胶上含有β‑葡萄糖苷酶的活性蛋白条带的位置；（5）提取：在2℃‑6℃条件下，以步骤（4）中染色凝胶胶条为导向，将步骤（3）中电泳凝胶上含有β‑葡萄糖苷酶的活性蛋白条带剪下，放入预冷研钵中磨碎后用pH为4.0‑5.5、质量浓度为10‑30mmol/L的柠檬酸‑柠檬酸盐缓冲液浸提10‑15h，再用5000道尔顿超滤管以3000‑5000r/min的转速离心15‑30min浓缩脱盐；（6）纯化：在2℃‑6℃条件下，将步骤（5）中的酶液洗脱分离蛋白质，洗脱分离蛋白质的工艺条件是以pH为7.2‑7.5的0.05‑0.10mol/l的PBS缓冲液添加0.15‑0.20mol/L的NaCl溶液为洗脱缓冲液、洗脱压力为73‑75psi、洗脱缓冲液流速为1‑3mL/min，得到精制β‑葡萄糖苷酶。