[发明专利]一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法

摘要

本发明公开了一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，含以下步骤1)离体动物角膜的制备和维持；2)受试物暴露；受试物浓度、暴露时间和后孵育时间的确定；3)受试物评价参数的选择；4)评价参数的测量；5)受试物眼刺激的评价与预测。本发明通过离体动物角膜短期体外维持培养，其类似于人体角膜且具有正常生理活性，通过受试物接触角膜后，对多个评价参数进行测量和分析，从而评价受试物重复/多重暴露后对角膜的影响，预测其潜在眼刺激性。本发明方法可以代替传统Draize兔眼试验，直接用于日化产品、化学品、药品等产品/原料/配方潜在眼刺激性进行比较、评价和预测，具有通量高、成本低和时间短等优点。

主权项

一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，其特征是包括以下步骤：S1，离体动物眼球的获取S1‑1，离体动物眼球来源于动物屠宰场，眼球的摘取应在动物死亡4h内进行；S1‑2，采用剪刀或类似器械从眼眶进入，切断与眼球连接的组织，完整取处眼球，摘取眼球的过程中不能接触或损伤眼球组织及眼球表面的角膜；S1‑3，将摘取下的眼球完全浸泡于含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素、且4℃预冷的无菌HBSS缓冲液，于7h内进行检测；S2，离体角膜的制备S2‑1，离体角膜指健康动物离体眼球分离的角膜，无肉眼可见的损伤或病变；S2‑2，分离角膜前肉眼检查角膜完整性，丢弃有划痕、色素沉着、白班、混浊、机械损伤或异常者；S2‑3，源于牛眼球的角膜直接分离，猪眼球应浸入含1％的聚维酮碘溶液2min，用无菌PBS冲洗，浸入含有0.1％庆大霉素的PBS 15min消毒后进行角膜分离操作；S2‑4，角膜分离应在洁净的环境下进行，紫外灯照射房间至少30min；S2‑5，角膜外周保留2‑3mm巩膜，以手术刀做切口，环切下角膜，夹住巩膜，用镊子剥除角膜内皮的玻璃体和虹膜附属组织，操作中不得直接接触角膜上皮或内皮组织；S2‑6，将角膜内皮朝上置于无菌32±1℃预热HBSS缓冲液中清洗1‑2次，去除附属残留组织；S2‑7，将角膜上皮朝上，放置于角膜固定器的后室部分；稳定放上前室部分，以螺丝固定前后室，期间避免移动前室，以免造成角膜损伤；S2‑8，角膜固定器的后室和前室分别依次填充无菌不含酚红的MEM培养基，水平置于32±1℃，RH70±10％的培养箱中孵育1～2h，以恢复角膜正常生理活性；S3，受试物和对照组暴露S3‑1，角膜孵育后，更换前后室培养基，依前后室顺序将液体抽出，依次向后室和前室重新加入新鲜培养基，用角膜浊度仪测量并记录每个角膜初始浊度值，根据浊度值进行角膜分组；S3‑2，每个角膜加入1±0.5ml(g)受试物，并确保受试物完全覆盖角膜；液体受试物直接从前室上方小孔加入，粘稠或固体受试物打开前室玻璃片，将受试物加入角膜表面；S3‑3，多参数暴露条件：根据受试物的不同，选择不同的暴露参数，所有阳性对照、阴性对照和溶剂对照均采用与受试物相同的暴露条件；S3‑4，竖直放置角膜固定器，使受试物与角膜充分接触，返回培养箱暴露；暴露结束后进行冲洗，以完全去除受试物，冲洗之后返回培养箱进行后孵育，后孵育结束后更换前后室培养基，再次测量并记录每个相应的角膜浊度值；S4，收集后室培养基，保存用于酶活性和/或炎性因子测定；S5，去除前室培养基，加入1ml荧光素钠溶液，继续孵育90分钟；收集后室所有液体，混匀后取液体360μL在490nm波长下读取吸光度值；S6，评价指标的测量A.肉眼观察，受试物暴露后，观察角膜颜色、状态或有无上皮脱落，记录并作为附加评价的参考；B.浑浊度(OP值)，角膜在受试物暴露前和暴露后浊度的变化，反应受试物对角膜的刺激性；C.渗透性(DO490)，受试物暴露后，通过荧光素钠定量，评估角膜上皮完整性；D.炎性物质的释放，LDH活性、IL‑6或IL‑8等细胞因子定量检测一个或多个炎性物质含量，并与做统计学分析，用于样品精细分析；E.组织学检测，完成试验后的角膜固定在固定液中，进行组织学评估，作为附加评价参考。S7，预测模型1)角膜体外评分＝校正OP值+15×校正OD4902)细分类模型：组织学评分，炎性物质释放刺激性体外评分 刺激性预测 ≤3 无刺激性 ＞3，≤15 微弱刺激性 ＞15，≤55 轻刺激性 ＞55 严重刺激性/腐蚀性     所有上述步骤中，涉及的所有操作器械经过无菌处理，所有的培养、暴露和孵育均处于无菌培养箱中，温度为32±1℃，湿度70±10％。