[发明专利]一种肿瘤组织块深低温冷冻方法

摘要

一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，涉及一种肿瘤组织冷冻方法。是要解决现有的组织冻存方法导致复苏后肿瘤细胞活性显著降低，成瘤率低的问题。方法：一、冻存液的配制；二、组织块的处理及冷冻；三、冻存肿瘤组织块复苏。本发明利用渗透性和非渗透性冻存保护剂结合的方法进行肿瘤组织冻存，同时对试剂的配制比例进行优化，使冻存液中DMSO的比例降低到2％，降低了组织细胞毒性，对冻存后的组织起到很好的保护作用，使其复苏后具有较高的小鼠成瘤性，成瘤率达到90％以上。本发明用于肿瘤组织冷冻。

主权项

一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、冻存液的配制：用DMEM将人血白蛋白冻干粉配制成质量浓度为10％～40％的人血白蛋白溶液，用DMEM将羟乙基淀粉配制成质量浓度为15％～25％的羟乙基淀粉溶液，用DMEM将乙二醇配制成质量浓度为20％～30％的乙二醇溶液，三种溶液分别用0.22μm滤器无菌条件下过滤备用；然后将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为(25‑30)：(10‑15)：(8‑12)：(1‑1.5)比例混合，得到冻存液，4℃预冷备用；二、组织块的处理：将肿瘤组织块用含双抗的hank’s液漂洗后，用不含双抗的生理盐水洗涤组织2～3次，用手术剪剪碎至1～2mm3的块状，然后加入步骤一配好的冻存液重悬组织块，按每管1mL分装到冻存管中；先于4℃平衡50min，使DMSO渗入组织，然后采用程控降温仪降温，具体为：20℃/min的速度降至‑55℃，再以10℃/min的速度升温至‑20℃，然后以2℃/min的速度降至‑40℃，接着以10℃/min的速度降至‑80℃，最后于‑196℃长期保存；三、冻存肿瘤组织块复苏：冻存12～24个月后，将冻存管从液氮中取出于37～38℃水浴快速解冻，冻存管内剩余1～2mm3冰块时停止水浴；取无菌的离心管，加入4℃预冷DMEM后将解冻后的组织块加入离心管中，4℃，1500～2000rpm离心5～10min后弃上清，用含3％～10％人血白蛋白的PBS洗涤组织两次后重悬组织于PBS中。