[发明专利]一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法

摘要

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以探针DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；然后以磁珠为载体固定发卡结构的捕获DNA，在目标物DNA存在时，捕获DNA的发卡结构被打开，并在化学发光探针上的探针DNA的杂交作用下，通过催化发卡自组装技术将化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，再加入羟胺‑O‑磺酸，以LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标DNA的测定。方法具有简单、灵敏度高的优势。

主权项

1.一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法，其特征在于以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以探针DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；然后以磁珠为载体固定发卡结构的捕获DNA，在目标物DNA存在时，捕获DNA的发卡结构被打开，并在化学发光探针上的探针DNA的杂交作用下，通过催化发卡自组装技术将化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，再加入羟胺‑O‑磺酸，以LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标DNA的测定；LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，提高了检测信号强度；在探针DNA引入两个错配碱基降低了背景信号，提高了测定灵敏度，测定步骤如下：(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备：实验开始前，将所用的玻璃仪器用王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干；取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01mL～5mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即LumAuNPs，将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用；(2)捕获DNA修饰磁珠的制备：取10μL～100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用10μL～200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01mL～2mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μL～200μL浓度为5.0×10^‑8M捕获DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到捕获DNA修饰磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中，4℃保存；(3)探针DNA修饰LumAuNPs的制备：将1μL～20μL的TCEP加到10μL～200μL浓度为1.0×10^‑6M的探针DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取100μL～1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μL～200μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris‑HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得探针DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针；最后得到的化学发光探针分散到1000μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用；(4)目标DNA的检测：取10μL～200μL捕获DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后取10μL～100μL含目标DNA的溶液加入到离心管中，37℃震荡反应40min，然后再加入10μL～100μL探针DNA修饰LumAuNPs溶液，37℃条件下震荡反应40min，通过目标DNA与捕获DNA的作用以及探针DNA与目标DNA和捕获DNA的作用，化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，将磁性分离物分散在50μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺‑O‑磺酸溶液，产生化学发光，利用化学发光仪测定化学发光强度，根据化学发光强度定量，实现目标DNA的测定。