[发明专利]一种分析IC50剂量δ-生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法

摘要

本发明公开了一种基于¹H NMR代谢组学方法分析IC₅₀剂量δ‑生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法，包括以下方法：(1)确定δ‑生育酚对RAW264.7或K562细胞的IC₅₀剂量；(2)细胞萃取液的制备；(3)核磁共振预处理；(4)¹H核磁共振检测；(5)差异性代谢物的筛选；(6)代谢通路分析。本发明应用氢谱核磁共振技术结合代谢组学方法，研究了不同细胞差异性代谢物以及代谢通路的影响，提供了一种研究δ‑生育酚对RAW264.7或K562细胞的亚毒性的分析方法。

主权项

1.一种IC50剂量δ‑生育酚对RAW264.7或K562细胞亚毒性的分析方法，其特征是，包括以下步骤：(1)确定δ‑生育酚对RAW264.7或K562细胞的IC50剂量；(2)细胞萃取液的制备：δ‑TOH组细胞萃取液的制备：将RAW264.7或K562细胞在相应的δ‑生育酚IC50剂量下进行培养，培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；空白组细胞萃取液的制备：将RAW264.7或K562细胞进行培养，培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，离心收集水相；(3)核磁共振预处理：将δ‑TOH组和空白组的水相蒸发后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2，2，3，3－四氘代丙酸钠(TSP)的D2O溶解，离心，冻干；将冻干之后的样品用D2O配制的磷酸盐缓冲液溶解，离心，得到上清液；(4)1H核磁共振检测：将核磁共振预处理后的δ‑TOH组和空白组的上清液进行核磁共振检测，获得细胞核磁共振谱图，从而得到RAW264.7或K562细胞样品中代谢物的信号值；(5)差异性代谢物的筛选：将细胞核磁共振谱图的积分面积进行归一化处理，得到积分面积数据，使用偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS‑DA)分析数据，并采用排列实验和CV‑ANOVA进行验证筛选差异性变量，选取偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)中第一主成分的变量权重重要性排序值>0.1的代谢物作为差异性代谢物，并得到差异性代谢物的相对含量值，定量各个差异性代谢物的变化趋势；(6)代谢通路分析：将确定的差异性代谢物导入京都基因与基因组百科全书数据库中，归属出相关的代谢通路；通过代谢组学数据分析软件MetaboAnalyst对差异性代谢物进行代谢通路富集分析，得到由差异性代谢物归属出的代谢影响分析通路以及代谢序列富集分析通路，代谢影响分析通路的通路影响值>0.1的代谢通路以及代谢序列富集分析通路的通路影响值<0.1的代谢通路均被识别为基于δ‑生育酚组受到显著影响的通路；最后从所述受到显著影响的通路中筛选出具有代表性的代谢途径。