[发明专利]一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法

摘要

本发明公开了一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法，包括：大豆预处理、培养基制备、种子制备、接种、变温发酵、干燥、粉碎等单元操作。该方法是集原料预处理、培养基与种子制备、接种、发酵、干燥和粉碎等技术为一体，整个过程是在洁净或无菌环境中进行，不会产生跑、冒、滴、漏等不良现象，易于达到GMP要求。与传统法相比，本发明具有如下特点：巧妙的原料预处理和多组分培养基的组方设计，为纳豆激酶产生菌的生长提供了良好的物质基础；表面活性剂的采用，使纳豆激酶的产生与分泌明显提高；变温发酵方法及工艺的应用，使纳豆激酶的产率提高10‑45%；方法科学，工艺合理先进，利于环保。本发明可广泛用于纳豆激酶及其它相关产品的研发和生产。

主权项

一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：⑴预处理大豆的制备；⑵发酵及种子培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；(6)干燥；(7)粉碎；具体方法步骤包括：⑴预处理大豆的制备预处理大豆的制备是指在定时消毒的洁净环境中按照如下工艺步骤进行：a.称量根据生产所需，称取所用量的无病虫害的干大豆；b.雾水润豆将上述大豆原料置于容器中，然后用喷雾水雾化大豆，翻拌均匀；c.适度破碎将上述润湿的大豆采用一定的破碎工具对大豆进行适度破碎，使破碎度达到每个大豆碎裂为6‑10片或米粒大小即可；d.加水浸泡将上述适度破碎的大豆置于消过毒的密闭浸泡罐中，按质量比加入3‑8倍的无菌水搅拌均匀后静置12‑24h；e.捞豆备用将上述适度破碎的浸泡好的大豆去水留（或取）豆，将大豆吸水膨胀用不完的多余水放出，导入它罐以备重复利用；⑵发酵及种子培养基的制备发酵培养基组成：包括如下质量的成分（g/L）：预处理大豆800‑980、葡萄糖2‑40、蔗糖3‑45、豆粕5‑100、多胨3‑65、胰蛋白胨2‑58、甘氨酸2‑76、丙氨酸1‑49、丝氨酸5‑56、赖氨酸3‑58、天门冬氨酸5‑50、组氨酸2‑46、亮氨酸1‑38、胶原蛋白肽0.05‑6.0、生物素0.01‑1.8、Vc 0.05‑4.0、Ve 0.04‑4.0、Vb5 0.05‑6.0、烟酸0.03‑4.0、烟酰胺0.05‑4.0、牛磺酸0.05‑4.0、L‑半胱氨酸或其盐酸盐0.05‑4.0、L‑胱氨酸0.04‑4.0、肝素钠0.02‑3.0、精氨酸0.03‑4.0、谷氨酸0.02‑4.0、吐温‑80 0.05‑4.0、酪蛋白酸钠0.8‑18.0、烷基糖苷APG 0.6‑16.0、辅酶Q10 0.02‑4.0、 MgSO4·7H2O 0.3‑6、CaCl2 0.2‑4，pH值=6.8‑7.4；种子培养基组成：上述培养基组分中去掉吐温‑80和烷基糖苷APG，其余组分及含量不变但要再加入10‑50倍去离子水；培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温‑80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在121℃灭菌20‑40min；.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在115℃灭菌15‑30min；.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36‑38℃培养箱中培养24‑32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36‑38℃培养箱中培养24‑32h后得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种，在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2‑5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的种子培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10‑20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10‑20倍的放大系数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；⑷接种将上述制备好的种子与制备好的发酵培养基在无菌条件下按质量比为1:5‑15的比例均匀拌入发酵培养基中；⑸变温发酵将接过种的培养基置于固态发酵罐中，装料系数为0.2‑0.5，然后在相对湿度为80‑95%条件下于42‑45℃发酵2‑4h，36‑38℃培养20‑30h，20‑28℃培养18‑26h即可，整个发酵过程中均伴随有间歇搅拌；(6)干燥将上述发酵产物在一定条件下进行真空冷冻干燥或真空干燥或低温干燥后，即可；(7)粉碎将上述干燥后的原料采用万能粉碎法或超微破碎法进行粉碎即得不同级别的产品，该类产品还可用作进一步的深加工。