[发明专利]具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法

摘要

本发明公开了具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法，它属于细胞培养技术领域。具体的培养方法为步骤一、配置培养基，步骤二、取样，步骤三、单个核细胞用500U/mL双抗的PBS，400g离心10min，充分漂洗3遍，接种在培养皿中，步骤四、第2‑6天，观察培养基颜色并计数，每2‑3天补加新鲜培养基，步骤五、第7天后，可将自体血浆含量降低1％，步骤六、纯化NK细胞，步骤七、利用无血清冻存液将纯化的CD56+NK细胞冻存于液氮中。此种取材容易、少量外周血或脐血即可获取大量具有活性的NK细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，并且取材来源广泛，体内储备量大，适宜自体治疗，无免疫原性。

主权项

具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法，其特征在于：具体的培养方法为：步骤一、配置培养基，每100mL MEM‑a培养基加入5mL血浆，加入IL‑2 10U/mL，IL‑15 100U/mL，IL‑21 10U/mL，以及SCF 50ng/mL，包被培养瓶，将纤黏蛋白用PBS或生理盐水稀释至0.1mg/mL，吸取5mL加入10cm培养皿中，在4℃包被过夜后，将残留液体吸出，待用；步骤二、取样：取5mL‑10mL静脉血或者脐血，活率≥90％，用于制备单个核细胞，取5mL‑10mL淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，离心15min，吸取上层液体即血浆层，用于后期细胞培养，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；步骤三、单个核细胞用500U/mL双抗的PBS，400g离心10min，充分漂洗3遍，接种在0.1mg/mL纤黏蛋白铺底的10cm培养皿中，将分离获得的单个核细胞按1.0‑2.0×106个/mL的浓度接种于包被过的细胞培养皿中，放置在37℃下，5％的CO2的饱和湿度的培养箱内培养；步骤四、第2‑6天，观察培养基颜色并计数，每2‑3天补加新鲜培养基，含5％自的体血浆，调整NK细胞密度为1.0‑2.0×106个/mL；步骤五、第7天后，可将自体血浆含量降低1％，根据细胞培养悬液体积选择扩瓶，T75培养瓶最大体积40mL，T175培养瓶最大体积200mL，利用流式细胞术检测CD3‑CD56+细胞比例，此类细胞为NK细胞；步骤六、纯化NK细胞，每107细胞加入90μL PBS.加入10μL CD56Micro Beads，混匀，4‑8℃，15min，此后，加入1‑2mL PBS，在1500r/min，4℃离心5min,弃上清，每108细胞用500μL PBS重悬，将LS/MS柱子安装到磁铁上，加入3mL PBS，重力作用自然流尽，将细胞液加入到柱子中，用3mL PBS洗脱三次，利用LS/MS柱子活塞，推出结合在磁珠上的细胞，为纯化的CD56+NK细胞；步骤七、利用无血清冻存液将纯化的CD56+NK细胞冻存于液氮中。