[发明专利]金银双金属三维有序大孔结构作为SERS基底用于心肾综合征多种蛋白质同时检测

摘要

一种金银双金属三维多孔SERS生物传感器，它是由功能化标记Ag@Au nanostar和Au/Ag/Au双金属三维有序多孔基底构成。用于进行SERS传感的纳米探针由Ag@Au nanostar上连接了标记抗体和拉曼信号分子构成，用于特异性识别抗原和提供信号；SERS基底由电沉积制备的多孔金基底辅助生长的三维多孔银构成，并通过离子溅射镀膜法在银层表面喷镀金膜来保护银层不受氧化且提供更好的生物相容性，制备过程简单，成本低廉，形貌有序均一，提供了一个热电子场，保证了SERS信号的稳定性和可重复性。通过在基底表面连接包被抗体来捕获抗原，构建特异性传感界面。本发明可对心肾综合征(CRS)的多种相关蛋白进行同时检测和成像。本发明公开了其制法。

主权项

一种基于金银双金属三维有序多孔基底的SERS生物传感器的制备方法，所述SERS生物传感器由功能化标记的纳米探针和金银双金属三维有序多孔SERS基底构成，其特征是包括如下步骤：步骤1.功能化标记的纳米探针的制备在17.4ml二次水中加入0.2mL 20Mm/L的硝酸银溶液，快速搅拌下加入0.6mL 30mM二水合柠檬酸钠溶液，快速加入0.2mL冰浴条件下新制的100Mm/L的硼氢化钠溶液，25℃条件下反应1h，室温敞口避光陈化2小时，得到银纳米粒子溶胶；在10ml 0.01Mm/L的CTAB溶液中加入0.435mL 1％的氯金酸溶液，快速搅拌下加入0.162mL 10Mm/L的硝酸银溶液和0.17mL 0.1M/L的抗坏血酸溶液，溶液变为无色后，加入上述制备的银纳米粒子溶胶0.5mL，溶液变为浅蓝色后，快速搅拌，继续反应4h，5500rpm离心10min分离后，用二次水洗2次，最后分散在5mL二次水中，得到Ag@Au nanostar溶胶，在溶胶中加入10μL 0.3mM/L的HS‑PEG‑COOH水溶液和0.5mL 1Mm/L 4‑MBA乙醇溶液，25℃磁力搅拌4小时，离心洗涤两次，分散在5mL PBS缓冲液中，得到Ag@Au NS@PEG‑COOH/4‑MBA纳米粒子；取100μL Ag@Au NS@PEG‑COOH/4‑MBA粒子，用EDC/NHS室温活化30min，加入30μL浓度为60μg mL‑1的标记抗体，4℃反应12h，用PBS离心‑分散洗涤两次，除去没有连接上的抗体，再将探针分散在100μL PBS中，得到Ag@Au NS@4‑MBA@Ab2纳米探针；步骤2.金银三维有序多孔SERS传感基底的制备首先利用过硫酸盐引发无皂乳液聚合的方法制备聚苯乙烯微球(PSM)用于组装有序模板；制备前，将苯乙烯用浓度为1M的NaOH溶液洗涤三次，称取10g苯乙烯加入140mL二次水中，在氮气保护下，70℃水浴中机械搅拌10min，接着加入0.23g过硫酸钾溶于10ml二次水的溶液，继续搅拌反应24h，PSM的直径可通过反应时间控制，将得到的白色乳状液自然冷却到室温，得到直径为600nm的单分散聚苯乙烯微球(PSM)；利用垂直沉积法在ITO电极表面沉积PSM模板，方法如下：将ITO电极分别用丙酮、无水乙醇、异丙醇超声洗涤15min，晾干备用；沉积前，再用无水乙醇将ITO电极超声洗涤10min，氮气吹干，将PS微球乳液稀释至0.2wt％，超声30min，随后将ITO电极垂直插入乳液中，在45℃下静置48h，得到PSM球紧密有序排列的ITO电极；接着，利用电沉积法在ITO电极上沉积金/银，首先利用循环伏安法在垂直沉积了PSM的ITO电极表面沉积一层薄薄的金层，以PH 9.4的碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲液为电解液，配制1mM氯金酸溶液，使用CHI 660D电化学工作站，三电极体系：ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极，氮气保护下，电压范围为‑1.1V到‑0.1V，扫描速度25mV/s，扫描段数为4段，然后通过电流‑时间(i‑t)曲线电沉积银基底，使用CHI 660D电化学工作站，三电极体系：ITO电极为工作电极，银电极为参比电极，铂电极为对电极，以pH 5.5的0.1M硝酸钠溶液为电解液，硝酸银的浓度为5mM，沉积电位为‑0.3V，氮气氛围下工作，通过控制电荷消耗量来控制沉积银的厚度，电沉积后，将ITO电极浸泡在四氢呋喃中过夜，使PSM模板溶解，二次水洗涤两次后，室温干燥得到金/银三维多孔结构，最后，利用离子溅射沉积法在银基底表面喷镀一层金膜，金膜厚度由喷镀时间控制；将多孔基底浸入0.3mM HS‑PEG‑COOH溶液中室温反应4h，用二次水洗涤两次后，用EDC/NHS室温活化30min，滴加10μL 60μg mL‑1的包被抗体，4℃反应12h，用PBS冲洗两遍洗去未连接上的抗体，即完成金银三维有序多孔SERS传感基底的制备；上述的功能化标记的纳米探针和金银三维有序多孔SERS传感基底构成SERS生物传感器。